Name: 新生儿缺氧的生化测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学习使用HPLC和GC/MS技术测量新生儿血浆中的次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸、尿囊素和MDA浓度，并测定黄嘌呤氧化酶活性。该方法有助于早期诊断新生儿缺氧缺血性脑损伤。

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本工作由美国国立卫生研究院 R01 NR011209-03 项目资助

<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
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<li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase%3A+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li>
<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
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<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
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<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
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<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文所述方法可用于评估新生儿缺氧缺血情况。该方案结合了能量（ATP）缺乏、氧化应激、氧化损伤以及酶活性等多类标志物的检测，以全面获取反映缺氧缺血存在与否甚至其严重程度的生化图谱。尽管该方法具有实用价值，但仍存在一些潜在局限性。首先，进行全部检测需要采集约1–2 ml血液以获得足够的血浆。对于成人或儿童而言这并非问题，但在处理新生儿样本时需格外谨慎，尤其是早产儿。我们通过优先选择关键检测项目并在必要时稀释部分样品来应对这一问题。其次，MMDA的合成可能较为困难；然而，可使用氘代MDA作为MMDA的替代物，作为内标使用。
尽管存在这些局限性，所描述的方法在评估新生儿缺氧缺血以及与氧化还原稳态失衡相关的其他疾病方面仍提供了有用的工具。此外，除黄嘌呤氧化酶（XO）外，所有这些生物标志物均可在尿液中检测，从而为监测新生儿提供了一种无创手段。

<table><tbody><tr><td>6 ml K3E EDTA K3 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>2204061</td><td></td></tr><tr><td>5702R 离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>05413319</td><td>配备 13&amp;amp;16MM 适配器</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1615-5599</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3509</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 100 分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td>0010071500</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SC210A-115</td><td></td></tr><tr><td>微孔离心滤膜装置</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC501596</td><td></td></tr><tr><td>Supelcosil LC-18-S 色谱柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>Supelcosil LC-18-S Supelguard 保护柱及柱套</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59629</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GCMS 小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03376607</td><td></td></tr><tr><td>DL-尿囊素-5&lt;sup&gt;-13&lt;/sup&gt;C;1&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt;N</td><td>CDN Isotopes</td><td>M-2307</td><td>批号 #L340P9</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>48920</td><td></td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>5973E 气相色谱/质谱检测器 (GC/MSD)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G7021A</td><td>5975E 气相色谱/质谱仪 (GC/MS) 的部件编号</td></tr><tr><td>3-乙氧基甲基丙烯醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>232548</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401765</td><td></td></tr><tr><td>二异丙基醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38270</td><td></td></tr><tr><td>BHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1378</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>苯肼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P26252</td><td></td></tr></tbody></table>

新生儿缺氧的生化检测

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

新生儿缺氧缺血的特征是组织灌注不足或全身性缺氧。该状况被认为可导致或加重多种已有明确记载的新生儿疾病，包括神经系统功能障碍1-3。由于氧化磷酸化受阻，三磷酸腺苷（ATP）的生成减少2。为补偿这种能量缺乏状态，含高能磷酸键的分子被降解。这导致腺苷水平升高，随后被进一步降解为次黄嘌呤、黄嘌呤，并最终转化为尿酸。该降解过程的最后两个步骤由黄嘌呤氧化还原酶催化完成。在常氧条件下，该酶以黄嘌呤脱氢酶的形式存在，但在缺氧-再灌注条件下会转化为黄嘌呤氧化酶（XO）4, 5。与黄嘌呤脱氢酶不同，XO在嘌呤降解过程中会产生过氧化氢作为副产物4, 6。这种过氧化氢与其他缺氧期间产生的活性氧（ROS）共同作用，可将尿酸氧化为尿囊素，并与脂质膜反应生成丙二醛（MDA）7-9。大多数哺乳动物（人类除外）具有尿酸酶，可将尿酸转化为尿囊素。然而在人类中，尿囊素只能通过活性氧介导的尿酸氧化反应生成。因此，尿囊素被认为是人类氧化应激的标志物，而在具有尿酸酶的哺乳动物中则不是。
我们描述了采用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱-质谱联用法（GCMS）来检测新生儿缺氧缺血生化标志物的方法。大多数检测使用人血。动物血也可使用，但需注意尿酸酶可能产生乙醛酸。早在1963年，嘌呤代谢物就已被关联到缺氧状态，且次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸作为新生儿缺氧生化指标的可靠性已被多位研究者证实10-13。用于定量嘌呤类化合物的HPLC方法快速、可靠且可重复。用于定量氧化应激相对较新标志物——乙醛酸的GC/MS方法改编自Gruber et al7。该方法可避免某些干扰因素，并仅需少量样本。MMDA的合成方法已在其他文献中描述14, 15。基于GC/MS的丙二醛（MDA）定量方法改编自Paroni et al 和 Cighetti et al16, 17。黄嘌呤氧化酶活性通过HPLC定量蝶呤转化为异黄蝶呤的过程进行测定18。该方法被证明具有足够的灵敏度和可重复性。

本文描述了一种检测新生儿缺氧缺血生化标志物的方法。该方法采用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）。

新生儿缺氧缺血的特征是组织血液灌注不足或全身性缺氧。该状况被认为会……

以下实验的总体目标是测定新生儿缺氧缺血的生化标志物。首先采集婴儿的血液样本以分离血浆。然后取部分血浆进行过滤，加入内标物，利用HPLC系统二检测黄嘌呤、三羟基嘌呤和尿酸的浓度。随后对更多血浆等分试样进行差异处理并分别分析。对于采用气相色谱-质谱联用仪（GCMS）检测尿囊素浓度和丙二醛（MDA）水平，该实验步骤的最后阶段是在终止反应后，将部分血浆与底物混合以启动酶促反应。黄嘌呤氧化酶活性可在配备荧光检测器的高效液相色谱仪（HPLC）上测定。最终获得的结果显示了峰面积的色谱图，这些峰面积可通过标准曲线转换为所需生化标志物的摩尔浓度或酶活性。该技术的意义在于新生儿缺氧缺血的治疗与诊断，因为该方法结合了能量缺乏、氧化应激、氧化损伤标志物及酶活性的测定，从而生成关于缺氧缺血存在与否甚至其严重程度的整体生化图谱。在本实验开始前，需在出生后立即从新生儿体内采集人血样本，并于五分钟内收集至6 mL EDTA抗凝管中。采集后，在 4 摄氏度、1,500 ×g 条件下离心样品 10 分钟。将上清液中的血浆转移至 1.5 毫升微量离心管中，再离心 30 分钟。移除上清液时需注意，避免红细胞污染样品。将样品分别转入不同的微量离心管中，用于每次嘌呤PLC测定中的嘌呤啉、MDA和黄嘌呤氧化酶分析。转移200微升血浆至离心过滤装置中。在4°C、14,000 × g条件下离心血浆1.5小时。移除滤液并转移至含有两个氨基嘌呤的微量离心管中。务必记录加入含有两个AP的微量离心管中的滤液体积，以准确测定浓度。将离心管涡旋振荡10至20秒。按照书面实验方案所述，使用高效液相色谱法（HPLC）分析样品，每份样品进样三次，每次 50 微升，根据所得色谱图确定样品中嘌呤的浓度。通过在相应保留时间及波长下获取峰面积，定量分析次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸。接下来，定量两个ap的峰面积。根据这些信息，可计算出黄嘌呤和尿酸相对于两个AP的峰面积比值。然后利用标准曲线将这些比值转换为微摩尔浓度。为测定兰宁含量，向50微升血浆中加入50微升内标物和100微升乙腈。将混合物涡旋振荡10至20秒后，离心10分钟。离心结束后，弃去上清液，并将其转移至GCM S小瓶中。在氮气下将液体吹干。液体干燥后，加入25 µL的衍生化试剂M-T-B-S-T-F-A和25 µL吡啶。盖紧小瓶，并在50 °C下孵育2小时。然后将样品转移至另一个含有300微升内插管的GCMS小瓶中。使用自动进样器在GCMS上分析样品。以氦气为载气，流速为1.5毫升/分钟，进行化合物分离。开始进行气相色谱-质谱（GCMS）分析时，输入运行参数。将色谱柱初始温度设为 100 摄氏度，并在此温度下保持 2 分钟，然后以每分钟 10 摄氏度的速率升温至 180 摄氏度。保持该温度 4 分钟后，再以每分钟 20 摄氏度的速率升温至 260 摄氏度。保持此温度直至运行结束。

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