超声靶向微泡破坏技术简介

UTMD 是超声靶向微泡破坏（ultrasound targeted microbubble destruction）的缩写。UTMD 可用于将生物活性分子定向递送至超声可及的靶器官（如心脏和肝脏），实现特定部位的递送，包括治疗性基因。在 UTMD 中，带负电荷的质粒、编码目的基因的 DNA 载体等生物活性分子被添加到脂质微泡造影剂的阳离子外壳上，将携带载体的微泡通过静脉注射或直接注入心室。

在较大的动物中，也可以通过冠状动脉导管输送，可选择是否留置一段时间。随后，通过微泡的共振频率下产生的声学空化效应，可实现从循环系统向靶器官的最佳递送。微泡破裂所产生的机械能可能导致靶区域微血管内皮细胞上或细胞间出现瞬时孔隙形成。

由于这种桑拿穿孔效应，转染进入内皮细胞及其跨细胞的效率得到提高，从而可将编码转基因的载体沉积到目标周围组织中。残留在循环中的质粒DNA会迅速被血液中的核酸酶降解。取一份已制备的微泡储备液，其中含有葡萄糖磷酸盐缓冲生理盐水、二油酰甘油三磷酸胆碱和二油酰甘油三。

将磷脂酰乙醇胺首先在40摄氏度孵育15分钟。随后将预热的微泡溶液转移至含有甘油和1至2毫克编码目的基因表达构建体的纯化质粒DNA的1.5毫升微量离心管中。加入磷酸盐缓冲盐水，使最终体积达到500微升。

随后，将微管中的空气替换为八氟丙烷气体。接着，将微管在牙科银汞合金振荡器中剧烈振荡20秒。在首次使用前，需对1兆赫UTMD空化换能器进行设备校准，以确保适当的机械指数和脉冲重复频率。

一个一兆赫兹的换能器通过功率放大器连接至波形发生器。将该换能器置于盛满水的塑料容器中，并正对一个水听器，水听器通过电荷放大器连接至示波器。通过调节波形频率、振幅、脉冲周期和功率放大，可调整至适当的占空比和机械指数，以实现微泡的有效空化。在此实验装置中，我们已将系统校准至机械指数约为1.3，对应于一兆赫兹微泡递送条件。在微泡递送前，对57只C57BL/6小鼠通过腹腔注射给予100毫克/千克的氯胺酮和5毫克/千克的赛拉嗪进行麻醉。

微泡递送通过直接注射至心脏左心室或尾静脉插管进行静脉给药，后续将展示直接心脏注射的操作。在超声引导下，通过插入小鼠胸壁前第四肋间间隙的30号针头，将最多100 µL载有血浆DNA的微泡溶液注入左心室。采用VisualSonics高频超声探头，以长轴切面固定于小鼠胸壁，可观察由左心室注射产生的微泡溶液团注情况。

注射后立即进行微泡破坏，持续约五分钟，使用第二个较小尺寸的低频（1.0兆赫）换能器，直接置于目标器官上方，以靶向该区域的微泡进行破坏。超声波以1.0兆赫的脉冲重复频率施加于肝脏，机械指数约为1.3至1.5，每20个周期脉冲重复周期为100毫秒；或者，超声脉冲可与小鼠心电图同步，在每四到六个心动周期中释放三个超声帧的脉冲。对于经尾静脉途径输送微泡的方法，小鼠的麻醉方式与注射含有质粒的注射器时相同。

将结合DNA的微泡连接至27号针头的尾静脉导管。将尾静脉导管插入小鼠尾部左侧或右侧侧静脉的远端三分之一处。装有微泡的注射器置于输注泵中，输注泵将在预设时间内自动输注设定的均匀体积溶液。

通过生物发光分析UTMD，可根据构建体中编码的基因，采用多种方法评估UTMD介导的血浆DNA递送效率。特别是，活体生物发光成像是一种可用于监测基因表达存在情况及其持续时间的方法。在转染了编码荧光素酶等生物发光报告基因质粒的小鼠中。

Enogen 体内成像系统用于生物发光检测。通常在UTMD介导的转染后第一天对所有小鼠进行成像，并每三到四天重复一次，直至通过该系统无法再视觉检测到生物发光基因表达。为准备小鼠进行生物发光成像，需首先通过腹腔注射给予荧光素酶报告探针Lucifer。

随后对小鼠进行麻醉。约三分钟后，让荧光素底物在体内分布约10分钟，然后将动物置入XenoGen成像室，在图像采集过程中对全身进行扫描，系统检测来自体内萤光素酶催化荧光素发生的生物发光反应所发射的光子，并在每幅图像采集完成后进行定量分析。

使用Xeno活体成像系统，通过系统软件测量并定量分析可见的发光兴趣区域。