Name: 有针对性的超声微泡销毁技术简介 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习超声靶向微泡破坏技术用于基因治疗，通过空化效应将质粒DNA递送至心脏和肝脏等靶器官。该方法利用微泡载体提高转染效率，实现精准的体内基因表达监测与治疗应用。

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本研究获得以下资助：NHLBI HL080532、NHLBI HL073449、NCRR RR16453，以及美国心脏协会（AHA）国家资助奖（授予 RVS）。特别感谢远程课程设计与咨询（DCDC）团队（dcdcgroup.org）在视频制作方面的协助，以及美国教育部资助项目编号 P336C050047 对 DCDC 的创建支持。

1. 微泡储备液的制备
<ol>
	<li>在 10 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 200 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、50 mg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和 1 g 葡萄糖，混匀。</li>
	<li>将混合物置于沸水浴中加热 20–30 分钟，每 5 分钟用移液器混匀一次。</li>
	<li>该溶液可在 4°C 下保存长达 6 个月。</li>
</ol>
2. 微泡制备
<ol>
	<li>取250 μl已制备的微泡储备液，于40°C孵育15分钟。</li>
	<li>将预热的微泡溶液转移至含有50 μl甘油的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>加入1–2 mg纯化的编码目的基因表达载体的质粒DNA（本示例中使用Qiagen内毒素去除型大提试剂盒（Qiagen，Germantown，MD）纯化，最佳浓度为4 mg/ml）。加入磷酸盐缓冲液至终体积为500 μl。使用无内毒素的Qiagen大提纯化试剂盒以及无菌PBS，以确保无菌性。</li>
	<li>随后用八氟丙烷气体置换微量离心管中的空气。</li>
	<li>将微量离心管在牙科合金振荡器中剧烈震荡20秒。</li>
	<li>小心移除未与微泡结合的残余DNA和缓冲液（下层液体），并将微泡层用无菌PBS洗涤三次，以去除未结合的DNA，每次洗涤之间将样品置于冰上。我们通常可达到30–40%的结合效率。所有试剂均为无菌，操作中注意尽量避免污染。</li>
	<li>质粒DNA结合的微泡可在冰上保存最多两小时，直至使用。</li>
	<li>混合后从微量离心管中移除的下层液体以及PBS洗涤液可用于测定未结合DNA的浓度，进而根据已知的初始浓度计算结合量，方法是使用分光光度计在260 nm波长下测定该溶液的光密度。</li>
</ol>
3. 仪器校准
<ol>
	<li>首次使用前，需对1 MHz空化换能器进行校准，以确保其具备适当的机械指数和脉冲重复频率。将一个可浸入式1 MHz、13 mm、非聚焦换能器通过功率放大器连接至20 MHz函数/任意波形发生器。</li>
	<li>将该换能器置于盛满水的塑料容器中，并正对已通过电荷放大器连接至500 MHz示波器的水听器。</li>
	<li>可调节波形、频率、振幅、脉冲周期和功率放大倍数，以获得适合微泡空化的最佳占空比和机械指数。在本实验中，我们已将系统校准至在1 MHz下机械指数约为1.3的水平。</li>
</ol>
4. 微泡递送与超声靶向微泡破裂技术
<ol>
	<li>在微泡递送和超声靶向微泡破坏（UTMD）之前，通过腹腔注射给予C57BL/6小鼠100 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪进行麻醉。</li>
	<li>微泡递送通过直接注射至心脏左心室或经尾静脉插管进行静脉注射。对于直接心脏注射，注射体积最高可达 100 μl 将质粒DNA负载的微泡溶液通过插入前部4处的30号针头注射th 在超声引导下，经肋间隙穿刺进入左心室。 </li>
	<li>通过将 Visual Sonics 公司的 38 MHz 高频超声探头固定于小鼠胸壁，在长轴切面下使用 VisualSonics Vevo 2100 成像系统观察经左心室注射产生的微泡溶液团注。所有注射器和针头均为无菌，以确保注射过程尽可能处于无菌环境。</li>
	<li>注射后立即使用第二个尺寸较小的低频1.0 MHz换能器，在目标器官上方直接进行约5分钟的微泡破坏，以实现对该区域的靶向破坏。本示例中，超声施加于肝脏，脉冲重复频率为1.0 MHz，机械指数约为1.3–1.5，每20个周期的脉冲重复周期为100 ms。 alternatively，可将脉冲与小鼠心电图（ECG）同步（本实验未显示），即每4–6个心动周期给予一次包含3帧超声的脉冲爆发。当采用允许在超声脉冲爆发间期毛细血管床重新充盈微泡的方案时，可获得更高的转染效率。 </li>
</ol>
5. 替代递送方法
我们选择重点介绍心室间注射，因为该操作较为复杂；但在许多情况下，例如微泡的长时间输注，尾静脉注射是首选方法。对于通过尾静脉递送微泡的方法，小鼠的麻醉方式相同。将含有质粒DNA结合微泡的注射器连接至27号针头/尾静脉导管。尾静脉导管插入小鼠尾部右侧或左侧侧静脉的远端三分之一处。含有微泡的注射器置于输液泵中，由泵自动在预设时间段内匀速输注设定体积的溶液。我们通常以每小时3 ml的速度输注200–300 μl。
动物使用
所有动物操作均遵循相关国家和/或地方动物福利机构规定的良好动物实验规范，所有动物实验均经适当委员会批准（夏威夷大学机构动物护理和使用委员会，批准编号 07-100-3）。实验中使用了适当的麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪），并备有镇痛剂（布比卡因和丁丙诺啡），但未实际使用。
6. 代表性结果：
通过构建体所编码的基因，可采用多种方法评估UTMD介导的质粒DNA递送效果，例如但不限于：荧光素酶 体内 成像，β-半乳糖苷酶 离体 染色和/或免疫组织化学。 
尤其需要注意的是， 体内 生物发光成像技术可对转染了编码生物发光报告基因（荧光素酶）质粒的小鼠体内基因表达的存在及持续时间进行连续监测。Xenogen 体内 成像系统（IVIS）（Caliper Life Sciences，Hopkinton, MA）用于生物发光成像。通常在UTMD介导转染后的第一天对所有小鼠进行成像，并每三至四天重复一次，直至通过该系统无法再视觉检测到生物发光基因表达（图1）。 
为准备小鼠进行生物发光成像，首先经腹腔注射荧光素酶报告探针D-荧光素（D-luciferin）（Caliper Life Sciences），约3分钟后对小鼠实施麻醉。待D-荧光素底物在体内分布约10分钟，将动物置入IVIS成像室并进行全身图像扫描。在数据采集过程中，检测来自萤火虫荧光素酶与D-荧光素之间光化学反应所发射的光子。图1还展示了UTMD后肝脏的类似IVIS生物发光成像结果，图2为使用抗荧光素酶一抗（Sigma-Aldrich）和AlexFluor-568标记的二抗（Invitrogen）对转染肝脏进行的荧光显微（100X）图像。可以明显看出，UTMD介导的肝脏转染不仅影响了内皮细胞，也影响了肝细胞。
<img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig1.jpg" alt="经UTMD处理的小鼠IVIS成像；心脏/肝脏靶向；荧光强度；比较数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 心脏靶向UTMD处理小鼠的Xenogen/IVIS成像。(A) 阴性对照小鼠：质粒 + PBS，随后进行心脏靶向UTMD；(B) 治疗组小鼠：质粒 + 微泡，随后进行心脏靶向UTMD；以及(C) 治疗组小鼠：质粒 + 微泡，随后进行肝脏靶向UTMD。
<img src="/files/ftp_upload/2963/2963fig2.jpg" alt="肝脏UTMD免疫组织化学，红色为抗荧光素酶，显微镜图像，质粒比较。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 肝脏UTMD的免疫组织化学染色（红色为抗荧光素酶）。(A) 无UTMD的质粒，(B) 含UTMD的质粒。共聚焦图像（100倍）；细胞核经DAPI染色呈蓝色。

<ol><li>Bekeredjian, R., Chen, S., Frenkel, P. A., Grayburn, P. A., Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+can+repeatedly+direct+highly+specific+plasmid+expression+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart.</a> Circulation. 108, 1022-1026 (2003).</li>
<li>Bekeredjian, R., Katus, H. A., Kuecherer, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+ultrasound+targeted+microbubble+destruction%3A+a+review+of+non-cardiac+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Ultraschall+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction: a review of non-cardiac applications.</a> Ultraschall Med. 27, 134-140 (2006).</li>
<li>Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+pancreatic+islets+in+vivo+by+ultrasound-targeted+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regeneration of pancreatic islets in vivo by ultrasound-targeted gene therapy.</a> Gene Ther. 17, 1411-1420 (2010).</li>
<li>Miao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+enhances+gene+delivery+of+human+factor+IX+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound enhances gene delivery of human factor IX plasmid.</a> Hum Gene Ther. 16, 893-905 (2005).</li>
<li>Shimoda, M., Chen, S., Noguchi, H., Matsumoto, S., Grayburn, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+non-viral+gene+delivery+of+human+vascular+endothelial+growth+factor+improves+revascularisation+and+restoration+of+euglycaemia+after+human+islet+transplantation+into+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo non-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor improves revascularisation and restoration of euglycaemia after human islet transplantation into mouse liver.</a> Diabetologia. 53, 1669-1679 (2010).</li>
<li>Shohet, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiographic+destruction+of+albumin+microbubbles+directs+gene+delivery+to+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Echocardiographic destruction of albumin microbubbles directs gene delivery to the myocardium.</a> Circulation. 101, 2554-2556 (2000).</li>
<li>Sirsi, S., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubble+Compositions%2C+Properties+and+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bubble+Sci+Eng+Technol%22%5BJournal%5D)">Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications.</a> Bubble Sci Eng Technol. 1, 3-17 (2009).</li>
<li>Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-targeted+microbubble+destruction+enhances+AAV-mediated+gene+transfection+in+human+RPE+cells+in+vitro+and+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-targeted microbubble destruction enhances AAV-mediated gene transfection in human RPE cells in vitro and rat retina in vivo.</a> Gene Ther. 16, 1146-1153 (2009).</li>
<li>Lindner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbubbles+in+medical+imaging%3A+current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).</li>
<li>Newman, C. M., Bettinger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+ultrasound+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: ultrasound for gene transfer.</a> Gene Ther. 14, 465-475 (2007).</li>
<li>Vancraeynest, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+injury+induced+by+ultrasound-targeted+microbubble+destruction%3A+evidence+for+the+contribution+of+myocardial+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Myocardial injury induced by ultrasound-targeted microbubble destruction: evidence for the contribution of myocardial ischemia.</a> Ultrasound Med Biol. 35, 672-679 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

UTMD 代表了一种新型的基因递送方法。作为一种平台技术，它可与多种潜在的基因治疗策略相结合，在需要高度组织特异性时递送多种生物活性分子。该技术的主要生物学局限性在于转染效率较低。另一个重要考虑因素是靶器官对超声的可及性，而骨骼或气体的介入会显著降低其可及性。该技术需要根据靶组织对操作方法进行优化11，并需具备声学基础知识，以减少组织损伤11并提高效率。然而，该方法为评估组织特异性转基因表达的效果提供了一种经济、快速且可重复的手段，并可能为某些疾病提供有效的治疗方案，尤其适用于低水平转基因表达即具治疗作用的情况。

<table><tbody><tr><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5911</td><td>微泡脂质壳的组分</td></tr><tr><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3275</td><td>微泡脂质壳的组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td>被认为可稳定微泡</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>被认为可防止微泡融合</td></tr><tr><td>八氟丙烷气体</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td>临床应用中使用的惰性气体</td></tr><tr><td>VialMix 牙科银汞合金振荡器</td><td>Bristol-Myers Squibb</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1 MHz，13 mm，非聚焦换能器</td><td>Olympus Corporation</td><td>A303S-SU</td><td></td></tr><tr><td>20 MHz 函数/任意波形发生器</td><td>Agilent Technologies</td><td>33220A</td><td></td></tr><tr><td>功率放大器</td><td>Krohn-Hite Co.</td><td>Model 7500</td><td></td></tr><tr><td>水听器</td><td>Bruel and Kjaer</td><td>Type 1803</td><td></td></tr><tr><td>电荷放大器</td><td>Bruel and Kjaer</td><td>Type 2634</td><td></td></tr><tr><td>500 MHz 示波器</td><td>LeCroy</td><td>9354L</td><td></td></tr><tr><td>VisualSonics&amp;rsquo; Vevo 2100 成像系统，配备 34 MHz 换能器</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>27G 一英寸尾静脉导管</td><td>VisualSonics, inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Genie Plus 注射泵</td><td>Kent Scientific</td><td>GENIE</td><td></td></tr></tbody></table>

超声靶向微泡破坏技术简介

Introduction to the Ultrasound Targeted Microbubble Destruction Technique

在超声靶向微泡破坏技术（UTMD）中，将生物活性分子（例如携带目的基因的带负电荷质粒DNA载体）添加到阳离子脂质微泡造影剂的外壳中7-9。在小鼠中，这些携带载体的微泡可通过静脉注射或直接注入心脏左心室；在较大的动物中，也可通过冠状动脉导管输注。随后，通过微泡共振频率下的声学空化效应，实现从血液循环向靶器官的递送。微泡破裂所产生的机械能很可能在靶向区域微血管内皮细胞膜上或细胞间形成瞬时孔隙10。由于这种声孔效应，外源基因穿过内皮细胞的转染效率得以提高，携带目的基因的载体被释放至周围组织中。残留在血液循环中的质粒DNA会迅速被血液中的核酸酶降解，这进一步降低了非超声照射组织的基因递送可能性，从而实现高度特异性的靶器官转染。

超声靶向微泡破坏技术（UTMD）可用于将生物活性分子（包括治疗性基因）特异性递送至超声可及的靶器官，例如心脏和肝脏1-6。

在UTMD中，将携带目的基因的带负电荷的质粒DNA载体等生物活性分子添加至脂质阳离子外壳中……

UTMD 是超声靶向微泡破坏（ultrasound targeted microbubble destruction）的缩写。UTMD 可用于将生物活性分子定向递送至超声可及的靶器官（如心脏和肝脏），实现特定部位的递送，包括治疗性基因。在 UTMD 中，带负电荷的质粒、编码目的基因的 DNA 载体等生物活性分子被添加到脂质微泡造影剂的阳离子外壳上，将携带载体的微泡通过静脉注射或直接注入心室。在较大的动物中，也可以通过冠状动脉导管输送，可选择是否留置一段时间。随后，通过微泡的共振频率下产生的声学空化效应，可实现从循环系统向靶器官的最佳递送。微泡破裂所产生的机械能可能导致靶区域微血管内皮细胞上或细胞间出现瞬时孔隙形成。由于这种桑拿穿孔效应，转染进入内皮细胞及其跨细胞的效率得到提高，从而可将编码转基因的载体沉积到目标周围组织中。残留在循环中的质粒DNA会迅速被血液中的核酸酶降解。取一份已制备的微泡储备液，其中含有葡萄糖磷酸盐缓冲生理盐水、二油酰甘油三磷酸胆碱和二油酰甘油三。将磷脂酰乙醇胺首先在40摄氏度孵育15分钟。随后将预热的微泡溶液转移至含有甘油和1至2毫克编码目的基因表达构建体的纯化质粒DNA的1.5毫升微量离心管中。加入磷酸盐缓冲盐水，使最终体积达到500微升。随后，将微管中的空气替换为八氟丙烷气体。接着，将微管在牙科银汞合金振荡器中剧烈振荡20秒。在首次使用前，需对1兆赫UTMD空化换能器进行设备校准，以确保适当的机械指数和脉冲重复频率。一个一兆赫兹的换能器通过功率放大器连接至波形发生器。将该换能器置于盛满水的塑料容器中，并正对一个水听器，水听器通过电荷放大器连接至示波器。通过调节波形频率、振幅、脉冲周期和功率放大，可调整至适当的占空比和机械指数，以实现微泡的有效空化。在此实验装置中，我们已将系统校准至机械指数约为1.3，对应于一兆赫兹微泡递送条件。在微泡递送前，对57只C57BL/6小鼠通过腹腔注射给予100毫克/千克的氯胺酮和5毫克/千克的赛拉嗪进行麻醉。微泡递送通过直接注射至心脏左心室或尾静脉插管进行静脉给药，后续将展示直接心脏注射的操作。在超声引导下，通过插入小鼠胸壁前第四肋间间隙的30号针头，将最多100 µL载有血浆DNA的微泡溶液注入左心室。采用VisualSonics高频超声探头，以长轴切面固定于小鼠胸壁，可观察由左心室注射产生的微泡溶液团注情况。注射后立即进行微泡破坏，持续约五分钟，使用第二个较小尺寸的低频（1.0兆赫）换能器，直接置于目标器官上方，以靶向该区域的微泡进行破坏。超声波以1.0兆赫的脉冲重复频率施加于肝脏，机械指数约为1.3至1.5，每20个周期脉冲重复周期为100毫秒；或者，超声脉冲可与小鼠心电图同步，在每四到六个心动周期中释放三个超声帧的脉冲。对于经尾静脉途径输送微泡的方法，小鼠的麻醉方式与注射含有质粒的注射器时相同。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

有针对性的超声微泡销毁技术简介

微泡的超声辐照是一种有前景的策略，可在降低的时间平均声功率下实现肿瘤消融，并实现治疗药物的靶向递送。本研究的目的是开发低占空比的超声脉冲策略和纳米载体，以最大程度地实现非热性微血管消融，并将载药递送至皮下C6胶质瘤。...

通过载药纳米颗粒递送与微血管消融实现小鼠胶质瘤的超声造影靶向治疗

微泡介导的聚焦超声破坏血脑屏障（BBB）是一种有前景的脑部靶向药物递送无创技术1-3。本方案概述了在大鼠模型中进行磁共振成像引导下经颅BBB破坏的实验操作流程。...

磁共振成像引导下利用经颅聚焦超声在大鼠模型中破坏血脑屏障

本文介绍了一种将超声微泡造影剂注射到活体离体晚期妊娠阶段小鼠胚胎中的实验方案。该方法可利用增强型高频超声成像技术，研究胚胎内的灌注参数及血管分子标志物。...

利用高频超声对小鼠胚胎进行对比成像

血脑屏障（BBB）可通过微泡介导的聚焦超声（FUS）实现暂时性开放。本文介绍了一种使用模块化FUS系统在体内进行高通量BBB开放的逐步操作方案，该系统便于非超声专业人员使用。...

一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

本实验方案可用于在细胞培养装置中实时测量空化活性，旨在探究实现成功药物递送和/或其他生物效应所需的条件。...

研究空化增强治疗

提出了一种快速且可靠的控制单个被捕获声学气泡形状振荡的技术，该技术基于两个气泡之间的聚并方法。这种稳态、对称性可控的气泡形状振荡可用于分析气泡界面附近产生的流体流动。...

声悬浮系统中非球形气泡振荡诱导的微流现象

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内...

利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

本文所述方案可用于表征用于超声触发药物递送应用的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 体外 和 体内...

用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

本方案概述了脂质微泡的制备方法，以及一种兼容的“一锅法”微泡放射性标记技术，该方法标记效率超过&gt;95%，无需纯化步骤，且能保持微泡的理化特性。该方法适用于多种不同的脂质微泡配方，可根据需要定制，以制备放射性标记和/或荧光标记的微泡。...

制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

已设计出一种循环压力生物反应器，可对心脏瓣膜组织施加生理和病理条件下的压力。LabVIEW...

设计一种用于循环压力生物反应器的装置 离体 主动脉心脏瓣膜的研究

学习超声靶向微泡破坏技术用于基因治疗，通过空化效应将质粒DNA递送至心脏和肝脏等靶器官。该方法利用微泡载体提高转染效率，实现精准的体内基因表达监测与治疗应用。

超声靶向微泡破坏技术简介

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