Name: 针对嗅球神经元采用组合在体内电穿孔和GAL4基于增强陷阱斑马鱼线 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T14:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习在体电穿孔结合GAL4增强子陷阱转基因斑马鱼品系技术，实现嗅球神经元特异性基因表达。该方法可精准靶向发育中的特定脑区，用于研究神经发育与基因功能。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R15 AREA 项目资助，授予 John Horne（NIMH；R15MH083221）。

1. 转基因胚胎
<ol>
	<li>本实验采用通过转座子介导的增强子捕获方法构建的转基因斑马鱼品系8。该转基因插入片段包含两个编码序列：KalTA4（一种经过斑马鱼优化的Gal4转录激活因子）和红色荧光蛋白mCherry。增强子捕获技术可获得一系列转基因斑马鱼品系，其转基因表达盒在内源性增强子序列的调控下表达。因此，根据特定增强子序列的身份，KalTA4和mCherry的表达被限制在发育中脑的特定区域。本研究所使用的Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5品系中，表达定位于后脑、前脑的多个区域，尤其重要的是嗅球8（见图1）。根据该表达模式以及表达盒在基因组中的定位，推测该转基因受zic4启动子调控8（另见<a href="http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main">http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/neuroimaging/lines_distel/main</a>）。</li>
	<li>通常将携带转基因插入片段的成年Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5杂合子鱼与野生型（AB）鱼交配，可获得约50%的转基因子代。（若需获得更高比例的转基因子代，可将两个杂合子个体进行交配。）</li>
	<li>为抑制色素形成并便于荧光成像，从受精后6–8小时（hpf）开始，用100 μM N-苯基硫脲（PTU）处理转基因胚胎。</li>
</ol>
2. 胚胎的固定
<ol>
	<li>在24-28 hpf时，将胚胎转移至不含PTU的卵水。使用荧光显微镜通过mCherry的表达鉴定转基因胚胎。用精细镊子去除转基因胚胎的卵膜。将去膜后的胚胎转移至含有电穿孔缓冲液和0.02%三卡因的培养皿中[电穿孔缓冲液：180 mM NaCl，5 mM KCl，1.8 mM CaCl2，5 mM HEPES，pH 7.2]4。在进行固定步骤前，等待2分钟使麻醉剂发挥作用。</li>
	<li>将低熔点琼脂糖溶于含三卡因的电穿孔缓冲液中，配制成0.5%的溶液，先用微波炉加热溶解，然后置于34-37°C培养箱中。待琼脂糖溶液温度平衡后，取一大滴（约500 μl）该溶液置于60 mm培养皿中央。向此琼脂糖液滴中加入6-8个已麻醉的胚胎。</li>
	<li>使用精细镊子（或剪去尖端的微量移液器吸头细端），将胚胎调整至朝向一致并排列成垂直的一列。为使琼脂糖凝固并将胚胎固定在位，将培养皿置于盛有2-3 mm厚冰层的大培养皿上。</li>
	<li>待琼脂糖完全凝固后，用含三卡因的电穿孔缓冲液浸没整个培养皿，确保液体完全覆盖凝固的琼脂糖液滴。</li>
</ol>
3. DNA表达质粒的显微注射
<ol>
<li>使用中量或大量质粒提取试剂盒（例如 Qiagen）制备 GFP 表达质粒。将质粒溶解于无菌水中，终浓度为 0.5 μg/μl，并加入 0.03% 酚红。在本实验所描述的针对嗅球的实验中，我们使用一种表达质粒，其包含在多个 Gal4 结合位点（14 个串联 UAS 序列和基础鱼类启动子 E1b）控制下的 EGFP 编码序列。使用该质粒时，仅在转基因表达 KalTA4 转录因子的细胞中才能表达 GFP，从而实现 GFP 的靶向表达。 
注意：此处我们使用酚红以可视化 DNA 注射过程，该方法适用于靶向发育中脑部其他区域的实验，只要这些区域可从脑室进入即可。对于需要荧光可视化的其他细胞类型，可考虑使用 Bodipy 或量子点染料，在荧光照明下观察注射过程。</li>
<li>微注射移液管可通过水平或垂直移液管拉制仪制备。加热和拉力参数设置将根据拉制仪类型、加热元件类型以及玻璃毛细管类型的不同而有所变化。 
使用 Sutter P-30 垂直拉制仪时，将加热值设为 980，拉力设为 960，以从带丝薄壁硼硅酸盐毛细管玻璃 [Sutter Instrument #BF100-78-10] 拉制出长而锥形、尖锐的移液管。使用该参数拉制的微注射移液管为封闭尖端，必须在注射前将其回拉断裂。</li>
<li>使用微量加样器吸头向注射移液管中加入 1–2 μl 的质粒 DNA 溶液。</li>
<li>将装有溶液的移液管安装并固定至压力注射系统的移液管夹持器中。</li>
<li>用精细镊子轻轻回拉装有溶液的移液管尖端，直至压力脉冲可产生红色 DNA 溶液的喷射释放。或者，也可通过快速穿入浸没的折叠实验室 Kimwipe 纸来实现尖端回拉断裂。 
注意：由于注射移液管初始为封闭状态，需手动回拉断裂，因此尖端尺寸和注射体积存在可变性。理想的注射移液管应在 24 hpf 胚胎中，通过 3–5 次注射脉冲（每次 100 ms，压力 40 psi）即可完全充满前脑脑室。</li>
<li>将质粒 DNA 溶液注射至发育中脑的脑室内，使 DNA 被迫靠近并插入即将形成嗅球的脑区。嗅球来源于前脑脑室最前端壁的细胞。因此，将注射移液管插入脑室，并使其指向发育中脑的前端，压力注射即可将 DNA 推入并分布于未来嗅球区域及其邻近部位。持续注射 DNA，直至在前脑脑室前端清晰可见红色染料。由于 DNA 会立即开始扩散并被稀释，因此注射后应尽快进行电穿孔步骤（例如在 10 秒内）。</li>
</ol>
4. 电穿孔
<ol>
	<li>使用自制电极进行电穿孔，电极由 Grass 皮下铂电极（Grass Technology #E2）制成。将电极连接至手持式探针，铂电极之间的最终间距应为 1 mm（电极制作细节见9）。通过将电极连接至 Grass SD-9 刺激器（Grass Technology，型号 SD-9），产生方波电穿孔脉冲。</li> 
	<li>将 SD-9 刺激器设置为单次输出、持续时间为 5 ms、电压为 70 伏的电穿孔脉冲。放置电极时，使正极位于胚胎前端附近，负极位于胚胎头部后方。使用 SD-9 刺激器的单脉冲模式手动触发约 7–8 次电穿孔脉冲，每次脉冲间隔约 1 秒。合适的电压取决于胚胎的发育阶段和所用的电压源。较年轻的胚胎需要较低的电压以避免损伤，而较年老的胚胎则需要较高的电压才能实现有效的电穿孔7。</li> 
	<li>电穿孔后，让胚胎在琼脂糖中恢复至少 10 分钟，然后再将其从琼脂糖中释放出来。</li>
	<li>使用精细镊子，轻轻沿胚胎轮廓划开琼脂糖以释放胚胎，注意避免直接接触胚胎本身。</li>
	<li>胚胎释放后，将其放回胚胎培养水（如需要可含 PTU），并在 28°C 条件下培养，直至进行 GFP 表达成像。</li>
</ol>
5. 胚胎成像的制片
<ol>
<li>将胚胎从含PTU的养鱼用水转移至含0.02%三卡因的养鱼用水中。麻醉剂作用需数分钟，请等待其生效后再进行后续包埋操作。</li>
<li>将低熔点琼脂糖用含三卡因的养鱼用水配制成0.5%溶液，通过微波加热溶解后，置于34–37°C培养箱中保温。待琼脂糖溶液温度平衡后，取一大滴（约300 μl）置于35 mm培养皿中央。将一个已麻醉的胚胎加入此琼脂糖液滴中。</li>
<li>使用精细镊子（或剪去尖端的微量移液器吸头细端），调整胚胎位置使其直立，以便在正置显微镜下观察发育脑的背侧视图（若使用倒置显微镜，则需采用不同的胚胎方位及可从底部观察的培养皿；参见12）。将培养皿置于盛有2–3 mm厚冰层的大培养皿上，使琼脂糖凝固。在凝固过程中，可能需用精细镊子重新调整胚胎方向，以确保胚胎不会倾倒至侧卧位置。</li>
<li>待琼脂糖完全凝固后，向培养皿中加入足量含三卡因的养鱼用水，确保液体完全覆盖凝固的琼脂糖液滴。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
尽管在电穿孔后6小时即可观察到GFP表达，但此处展示的是电穿孔后4天胚胎的图像，以确保靶向细胞的神经突结构已充分发育。Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5转基因增强子捕获品系在受精后5天的胚胎中，于后脑、小脑、前脑和嗅球内组成性表达mCherry（以及KalTA4）（图1A和1C）。通过靶向电穿孔（如上所述）导入UAS-GFP表达质粒的胚胎，其GFP表达仅局限于发育中嗅球的细胞（图1B、1D和1E）。只有那些通过转基因方式表达KalTA4转录因子的细胞才能激活该UAS-GFP质粒的表达。将该质粒导入非转基因胚胎中不会产生任何可检测到的GFP表达。因此，正是UAS-GFP的靶向电穿孔与KalTA4驱动因子的局部转基因表达共同作用，导致GFP仅在发育中嗅球的细胞中特异性表达。表达GFP的细胞显示出典型的嗅球僧帽细胞轴突投射形态（图1B和1D）10。为了清晰显示轴突投射，图1B和1D的图像需采用高曝光水平拍摄，导致细胞体区域严重过曝。较低曝光水平的图像（图1E）显示，表达GFP的细胞体确实定位于嗅球内（比较图1C与图1E；灰色线条标记嗅球边界）。
<img src="/files/ftp_upload/2964/2964fig1.jpg" alt="转基因表达示意图；mCherry、GFP荧光，比较基因表达的显微图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 在5天龄斑马鱼胚胎嗅球中靶向表达的GFP。转基因增强子捕获系 Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 在后脑、小脑、前脑和嗅球中组成型表达mCherry（A 和 C，mCherry荧光显示为红色）。该mCherry表达由转基因Gal4表达介导。在受精后28小时通过电穿孔导入UAS-GFP表达载体的胚胎，在受精后5天于嗅球中表现出靶向的GFP表达（B, D 和 E，GFP荧光显示为绿色；与 A 和 C 为同一胚胎）。底部较低曝光的图像（E）显示GFP表达局限于嗅球的细胞体。灰色线条标示了嗅球的边界。明场（灰度）、绿色荧光（绿色）和红色荧光（红色）图像均使用Olympus BX60荧光显微镜拍摄。

<ol><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparking+new+frontiers%3A+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev Biol. 233, 13-21 (2001).</li>
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<li>Zhu, P., Narita, Y., Bundschuh, S. T., Fajardo, O., Schärer, Y. P., Chattopadhyaya, B., Bouldoires, E. A., Stepien, A. E., Deisseroth, K., Arber, S., Sprengel, R., Rijli, F. M., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Front Neural Circuits. 3, 21-21 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文描述了一种在斑马鱼中应用的体内电穿孔方法，该方法利用增强子捕获Gal4转基因品系，将电穿孔导入的转基因特异性地表达于发育中嗅球的特定细胞群体。该策略结合了体内电穿孔优异的时间分辨率7与增强子捕获转基因品系所介导的细胞类型特异性表达8。尽管本文重点描述了对嗅球的靶向，但体内电穿孔亦可用于靶向发育中神经系统的其他区域2-7，且已有多种增强子捕获品系可实现Gal4在不同特定细胞类型或组织中的靶向表达8, 11。当然，该电穿孔技术同样适用于其他组合式遗传学方法，例如LexA或Tet系统13, 14, 15。电穿孔的一大优势在于，只要存在合适的Gal4品系，便无需额外构建新的转基因品系，从而可节省六个月时间。
体内电穿孔技术能够将寡核苷酸导入神经元及其前体细胞中，适用于神经系统发育过程中任意特定阶段的研究7。这种时间上的精确控制在功能缺失分析中具有显著优势，因为它可以避免靶向在早期发育阶段具有关键功能的基因时所遇到的问题。本文所述方法还可用于导入功能缺失试剂，包括RNA干扰寡核苷酸或其表达载体，以及吗啉代反义寡核苷酸4, 7。由质粒驱动的试剂，例如显性负性蛋白表达质粒或短发夹RNA干扰质粒，也可置于Gal4 UAS系统调控之下，从而实现细胞类型特异性的精确表达，正如本文中GFP表达所示。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;试剂：&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;低熔点琼脂糖（Sigma，A9414）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;质粒中提或大提试剂盒（例如 Qiagen，#12643）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;酚红（Sigma，P3532）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;设备：&lt;/p&gt;&lt;ul&gt;&lt;李&gt;带纤维丝的毛细玻璃管；内径 = 0.78 mm；外径 = 1.0 mm（Sutter Instruments，#BF100-78-10）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Grass SD-9 刺激器（Grass Technology，型号 SD-9） &lt;/li&gt;&lt;李&gt;Grass铂金皮下电极，直针型（Grass Technology，#E2）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;微量加样器吸头（Eppendorf，#X22703R）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;移液管拉制仪（例如 Sutter，型号 P-30）&lt;/li&gt;&lt;李&gt;移液管拉制仪（例如 Sutter，型号 P-30）&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

联合靶向嗅球神经元 体内 电穿孔与基于gal4的增强子捕获斑马鱼品系

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

体内电穿孔是一种强大的方法，可将DNA表达质粒、RNA干扰试剂以及吗啉代反义寡核苷酸递送至发育中胚胎的特定区域，包括线虫（C. elegans）、鸡胚、爪蟾（Xenopus）、斑马鱼和小鼠的胚胎1。在斑马鱼中，体内电穿孔已被证明在递送这些试剂方面具有优异的空间和时间分辨率2-7。该方法的时间分辨率非常重要，因为它允许在发育的特定阶段引入这些试剂。此外，由于电穿孔载体的表达在6小时内即可发生7，因此该方法比转基因方法更及时。虽然在靶向单个细胞时，该方法的空间分辨率可以极高2, 6，但通常更希望将试剂导入组织或结构中的特定细胞群体。在靶向多个细胞时，体内电穿孔能够高效地将试剂递送至胚胎的特定区域；然而，在发育中的神经系统中，仅通过空间离散的电穿孔难以特异性地靶向特定类型的细胞。另一种方法是使用增强子捕获转基因品系，其可实现外源基因在特定细胞类型中的高效特异性表达8。本文中，我们描述了一种结合基于Gal4的增强子捕获转基因品系8与空间离散的体内电穿孔技术7, 9的方法，用于特异性靶向斑马鱼嗅球中正在发育的神经元。此前已报道的增强子捕获品系Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5（曾称为GA80_9）8，在发育中的脑部多个区域（包括后脑、小脑、前脑和嗅球）表现出由斑马鱼优化的Gal4转录激活因子（KalTA4）介导的mCherry靶向性转基因表达。为了特异性地在嗅球中表达GFP，我们在受精后24–28小时（hpf）将携带受多个Gal4结合位点（UAS）调控的GFP编码序列的质粒电穿孔至前脑前端。尽管该方法会将质粒DNA导入前脑的多个区域，但GFP的表达仅在那些通过转基因表达KalTA4转录因子的细胞中被诱导。因此，利用GA080_9转基因品系，该方法实现了GFP在发育中嗅球中的特异性表达。通过该方法靶向表达GFP的细胞表现出典型的轴突投射特征，这与此前报道的嗅球僧帽细胞的特征一致10。该方法也可用于靶向递送其他试剂，例如短发夹RNA干扰表达质粒，从而为实现空间和时间上离散的功能缺失分析提供一种有效手段。

遗传操作的时间和空间分辨率决定了其能够干扰的生物学现象的范围。本文中，我们采用具有时间与空间特异性的 体内 电穿孔结合转基因斑马鱼品系，以在发育中的嗅球神经元中特异性诱导GFP转基因的表达。

联合靶向嗅球神经元 体内 电穿孔与基于Gal4的增强子捕获斑马鱼品系

活体电穿孔是一种将DNA表达质粒、RNA干扰试剂和吗啉代反义寡核苷酸递送至特定...

该方法展示了如何将时间与空间上精确的活体电穿孔技术与转基因斑马鱼品系相结合，以选择性地靶向发育中胚胎的特定区域进行转基因表达。实验起始于通过增强子捕获法构建的cal TA4转基因斑马鱼品系，该品系可限制特定基因表达及目标细胞类型。在此案例中，针对发育特定时期中的嗅球，在发育的特定时间点将GFP报告基因质粒注射至前脑前端，并在活体内进行电穿孔以促进DNA递送。通过活体荧光成像获得的结果表明，转基因在特定发育时间点及发育过程中实现了精确定位。与现有的在单细胞阶段注射质粒的方法相比，该技术的主要优势在于能够将基因表达靶向至发育中脑部特定区域内的特定细胞类型。利用通过介导增强子捕获法创建的转基因斑马鱼品系，驱动转录因子 calt A four 和报告蛋白 M cherry 在发育中脑部的特定区域表达。将携带转基因插入片段的杂合子成年鱼与野生型鱼进行交配，以获得约 50% 的转基因子代。现在用100微摩尔浓度的苯硫脲（PTU）处理转基因胚胎，从受精后6至8小时开始，以抑制色素形成，并在受精后24至28小时便于进行荧光成像。将胚胎转移至不含PTU的养卵水中，在荧光显微镜下通过观察M樱桃（M cherry）在微波中的表达情况鉴定转基因胚胎。在电穿孔缓冲液中加入Trica，配制0.5%的低熔点琼脂糖溶液，然后将该溶液平衡。在34至37摄氏度的培养箱中，将一大滴约500微升的农杆菌溶液置于60毫米培养皿的中央。使用精细镊子从转基因胚胎中去除柯里安膜。将游离的胚胎转移至含有电穿孔缓冲液加0.02%三卡因麻醉剂的培养皿中，持续两分钟。现在使用剪裁过的迈克尔加样器吸头，将六至八枚麻醉后的胚胎转移至预先准备好的 aros 液滴中。将胚胎摆放成同一方向，并排列成一条垂直的直线。用含有两到三毫米厚冰层的大培养皿使 aros 固化，从而将胚胎固定在原位。用含有 trica 的电穿孔缓冲液浸没培养皿，确保溶液完全覆盖凝固的 aros 滴。将纯化的 GFP 表达质粒与酚红染料混合，用于注射。现在使用微量进样器吸头制备显微注射移液器。向注射移液管中加入一到两微升的质粒DNA溶液，然后将装有溶液的移液管安装并固定到压力注射系统的移液管夹持器中。将装好的移液管迅速插入浸没的无尘擦拭纸中，回拉至施加压力脉冲时红色DNA溶液从移液管尖端向前脑发育方向喷出为止。通过压力注射将质粒DNA溶液注入发育中脑室。将DNA推入即将发育的嗅球附近区域。注射DNA直至前脑脑室前端清晰可见红色染料。立即进行电穿孔步骤，以防止DNA扩散和稀释。将SD九刺激器设置为产生单次持续五毫秒的电穿孔脉冲，电压为70伏。放置电极时，使正极位于胚胎内侧末端附近，负极位于胚胎头部后方。使用 SD nine 刺激器的单个遥控制器手动启动八次电穿孔脉冲，每次脉冲间隔一秒钟。让胚胎至少恢复 10 分钟。现在使用精细镊子，轻轻勾勒出胚胎的轮廓，同时避免与胚胎本身直接接触。随后将胚胎从琼脂中分离出来。将胚胎放回养胚水中，并在28摄氏度下保存，直至进行GFP表达分析。将胚胎转移至含有0.02%三卡因麻醉剂的养鱼用水中数分钟，操作同前，但置于较小的35毫米培养皿中央。加入一大滴0.5%低熔点琼脂糖溶液与含三卡因的养鱼用水。现在使用剪切过的微量移液器吸头，将一个已麻醉的胚胎加入该琼脂糖液滴中。将胚胎竖直放置，以便在直立显微镜下观察发育中脑的背侧视图。将 aros 在冰上凝固，并使用剪切过的微量移液器吸头维持胚胎的方向。最后，向培养皿中加入含有 trica 的蛋水，确保溶液完全覆盖已凝固的 aro 液滴。该实例结合了活体电穿孔的时间分辨率与由增强子捕获转基因品系介导的细胞类型特异性表达，以靶向发育中的嗅球。该转基因增强子捕获品系在受精后五天的胚胎中，于后脑小脑、前脑以及嗅球内组成性表达 m cherry 和 calt A 四。重要的是，在电穿孔四天后，表达 GFP 的细胞显示出嗅球僧帽细胞典型的轴突投射特征。M Cherry 信号与较低曝光度的 GFP 信号的比较表明，表达 GFP 的细胞体确实定位于嗅球。利用短发夹 RNA 构建体，该方法还可用于诱导发育中脑部特定细胞类型的基因功能缺失。

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针对嗅球神经元采用组合在体内电穿孔和GAL4基于增强陷阱斑马鱼线

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多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

本视频展示了一种方法，该方法结合了电穿孔技术和共聚焦显微镜技术，用于对发育中的斑马鱼前脑中的单个神经前体细胞进行活体成像。体内水平上对前脑神经前体细胞在克隆水平的发育过程分析可通过此方法实现。...

延时活体成像观察发育中斑马鱼前脑内克隆相关神经前体细胞

本视频介绍了通过激活基因改造的体感神经元，并使用高速摄像机记录所引发的行为反应的光遗传学技术。...

斑马鱼光遗传学：激活基因改造的体感神经元以研究幼鱼行为反应

本视频展示了利用基于钙离子指示剂的荧光成像方法研究转基因斑马鱼幼鱼视觉捕食探测的技术，其实现方式为使其神经元表达荧光钙离子指示剂复合物。...

分析转基因斑马鱼幼虫中由猎物引发的神经元活动

来源： Muto, A., et al．利用双光子激光消融神经元群体并结合钙成像与斑马鱼幼鱼行为记录进行评估．J. Vis. Exp. (2018)...

利用双光子显微镜在斑马鱼幼体中进行靶向神经元消融

本方案描述了在斑马鱼中利用Gal4-VP16作为主要报告基因、GFP/RFP作为次要报告基因进行基因捕获插入突变的方法。大约每十尾高表达的F0代鱼中，就有一尾能够产生同时表达GFP和RFP的基因捕获后代。该筛选流程可轻松扩展，以适应进行插入突变筛选实验的实验室规模。...

利用Gal4在斑马鱼中进行基因捕获

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使用ChEF-tdTomato对斑马鱼体感神经元进行光遗传学激活

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

本文介绍了一种用于在成年斑马鱼端脑中递送质粒DNA并标记室管膜胶质细胞的电穿孔方法。该方案是一种快速高效地观察和示踪单个室管膜胶质细胞的技术，为将电穿孔技术应用于广泛的遗传操作提供了新的可能性。...

成年斑马鱼端脑内质粒DNA体内递送的电穿孔方法

本方案描述了如何通过结合获取图像的方法 原位 斑马鱼胚胎切片的杂交与免疫组织化学 原位...

原位 杂交联合免疫组织化学在冰冻切片斑马鱼胚胎中的应用

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

学习在体电穿孔结合GAL4增强子陷阱转基因斑马鱼品系技术，实现嗅球神经元特异性基因表达。该方法可精准靶向发育中的特定脑区，用于研究神经发育与基因功能。

联合靶向嗅球神经元体内电穿孔与基于Gal4的增强子捕获斑马鱼品系

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