联合靶向嗅球神经元 体内 电穿孔与基于Gal4的增强子捕获斑马鱼品系

该方法展示了如何将时间与空间上精确的活体电穿孔技术与转基因斑马鱼品系相结合，以选择性地靶向发育中胚胎的特定区域进行转基因表达。实验起始于通过增强子捕获法构建的cal TA4转基因斑马鱼品系，该品系可限制特定基因表达及目标细胞类型。在此案例中，针对发育特定时期中的嗅球，在发育的特定时间点将GFP报告基因质粒注射至前脑前端，并在活体内进行电穿孔以促进DNA递送。通过活体荧光成像获得的结果表明，转基因在特定发育时间点及发育过程中实现了精确定位。

与现有的在单细胞阶段注射质粒的方法相比，该技术的主要优势在于能够将基因表达靶向至发育中脑部特定区域内的特定细胞类型。利用通过介导增强子捕获法创建的转基因斑马鱼品系，驱动转录因子 calt A four 和报告蛋白 M cherry 在发育中脑部的特定区域表达。将携带转基因插入片段的杂合子成年鱼与野生型鱼进行交配，以获得约 50% 的转基因子代。

现在用100微摩尔浓度的苯硫脲（PTU）处理转基因胚胎，从受精后6至8小时开始，以抑制色素形成，并在受精后24至28小时便于进行荧光成像。将胚胎转移至不含PTU的养卵水中，在荧光显微镜下通过观察M樱桃（M cherry）在微波中的表达情况鉴定转基因胚胎。在电穿孔缓冲液中加入Trica，配制0.5%的低熔点琼脂糖溶液，然后将该溶液平衡。

在34至37摄氏度的培养箱中，将一大滴约500微升的农杆菌溶液置于60毫米培养皿的中央。使用精细镊子从转基因胚胎中去除柯里安膜。将游离的胚胎转移至含有电穿孔缓冲液加0.02%三卡因麻醉剂的培养皿中，持续两分钟。

现在使用剪裁过的迈克尔加样器吸头，将六至八枚麻醉后的胚胎转移至预先准备好的 aros 液滴中。将胚胎摆放成同一方向，并排列成一条垂直的直线。用含有两到三毫米厚冰层的大培养皿使 aros 固化，从而将胚胎固定在原位。

用含有 trica 的电穿孔缓冲液浸没培养皿，确保溶液完全覆盖凝固的 aros 滴。将纯化的 GFP 表达质粒与酚红染料混合，用于注射。现在使用微量进样器吸头制备显微注射移液器。

向注射移液管中加入一到两微升的质粒DNA溶液，然后将装有溶液的移液管安装并固定到压力注射系统的移液管夹持器中。将装好的移液管迅速插入浸没的无尘擦拭纸中，回拉至施加压力脉冲时红色DNA溶液从移液管尖端向前脑发育方向喷出为止。通过压力注射将质粒DNA溶液注入发育中脑室。

将DNA推入即将发育的嗅球附近区域。注射DNA直至前脑脑室前端清晰可见红色染料。立即进行电穿孔步骤，以防止DNA扩散和稀释。

将SD九刺激器设置为产生单次持续五毫秒的电穿孔脉冲，电压为70伏。放置电极时，使正极位于胚胎内侧末端附近，负极位于胚胎头部后方。

使用 SD nine 刺激器的单个遥控制器手动启动八次电穿孔脉冲，每次脉冲间隔一秒钟。让胚胎至少恢复 10 分钟。

现在使用精细镊子，轻轻勾勒出胚胎的轮廓，同时避免与胚胎本身直接接触。随后将胚胎从琼脂中分离出来。将胚胎放回养胚水中，并在28摄氏度下保存，直至进行GFP表达分析。

将胚胎转移至含有0.02%三卡因麻醉剂的养鱼用水中数分钟，操作同前，但置于较小的35毫米培养皿中央。加入一大滴0.5%低熔点琼脂糖溶液与含三卡因的养鱼用水。现在使用剪切过的微量移液器吸头，将一个已麻醉的胚胎加入该琼脂糖液滴中。

将胚胎竖直放置，以便在直立显微镜下观察发育中脑的背侧视图。将 aros 在冰上凝固，并使用剪切过的微量移液器吸头维持胚胎的方向。最后，向培养皿中加入含有 trica 的蛋水，确保溶液完全覆盖已凝固的 aro 液滴。

该实例结合了活体电穿孔的时间分辨率与由增强子捕获转基因品系介导的细胞类型特异性表达，以靶向发育中的嗅球。该转基因增强子捕获品系在受精后五天的胚胎中，于后脑小脑、前脑以及嗅球内组成性表达 m cherry 和 calt A 四。重要的是，在电穿孔四天后，表达 GFP 的细胞显示出嗅球僧帽细胞典型的轴突投射特征。

M Cherry 信号与较低曝光度的 GFP 信号的比较表明，表达 GFP 的细胞体确实定位于嗅球。利用短发夹 RNA 构建体，该方法还可用于诱导发育中脑部特定细胞类型的基因功能缺失。