结合外加交变电场刺激与高速图像分析研究外毛细胞运动性

本实验的总体目标是建立一种可靠的方法，用于研究外毛细胞（OHC）的运动反应，包括电致运动、慢运动以及在声频范围内的弯曲运动。该方法首先从豚鼠、小鼠或其他哺乳动物中取出颞骨，打开鼓室以暴露耳蜗。第二步是将耳蜗浸入Lebovits L 15溶液中，去除骨性耳蜗壳的顶端区域、螺旋韧带和血管纹，并取出柯蒂氏器。

将耳蜗柯蒂氏器在每毫升含一毫克胶原酶的溶液中孵育五分钟之后，使用50微升汉密尔顿注射器将其转移至记录室，并通过针头反复回流使细胞解离。随后将记录室移至显微镜下，利用外部交变电场刺激细胞，并使用高速相机对分离的外毛细胞的运动反应进行视频记录。最终，可通过计算机辅助图像分析评估外毛细胞的电致运动性、慢运动性以及在声频范围内的弯曲行为。

开始此操作时，首先从豚鼠、小鼠或其他哺乳动物模型中采集颞骨。然后使用骨钳打开颞骨。为暴露耳蜗，请小心去除多余的骨组织，同时保持耳蜗骨性外壳完整，并将其浸入L-15培养基中。

在显微镜下，打开耳蜗的顶端区域。用手术刀片尖端、微型尖头镊子或精细镊子去除干燥组织、血管纹（VASIs）和螺旋韧带。用镊子将柯蒂氏器从耳蜗骨螺旋板上分离下来。

接下来，将耳蜗置于1毫克/毫升的胶原酶中，在室温下孵育5分钟。如果需要获取耳蜗基底回的毛细胞，用解剖针去除覆盖耳蜗基底部的骨性外壳，并用手术刀片将耳蜗螺旋结构从颞骨上分离。在移除柯蒂器官之前，使用50微升Hamilton注射器将柯蒂器官转移至记录室。然后通过针头反复吹打使细胞解离。

以下是外部交变电场发生器的示意图，以及其与图像采集系统、控制电路和在美国 House Ear 研究所工程核心特别开发的软件之间的连接。本实验所用的实验装置包括一台 Axia vert 1 3 5 TV 倒置显微镜，配备基于 LED 的可选照明系统和两个电子显微操作器。显微镜上装有三个摄像头，其中一个是由计算机控制的超高速 PhotoTron FastCam PCI X1024 摄像头，安装在 Teleport 上，具有高分辨率，能够以高达 100,000 FPS 的频率采集图像。

高速摄像机提供的图像可直接在电脑显示器上观察。目镜端口连接了一个额外的常规CCD相机，并接入高分辨率显示器。前端端口配备了一台常规数码相机，可用于捕捉静态图像，同一台电脑上运行的自制软件可控制高速摄像机的触发、照明系统以及外部交变电场装置。

两个电极由固定在电动显微操作器上的两根直径为0.25毫米的银丝组成，其尖端间距为0.8毫米。接下来，使用外部电极校准电场。该电极测量不同位置的电势，从而生成电场分布图。

若将一个孤立的外毛细胞置于电极尖端之间，使其长轴与施加的交变电场方向平行，则该细胞会随着电场频率同步伸长和缩短。例如，此处显示的是一个以50赫兹刺激并以每秒1000帧记录的细胞。下一张图像显示的是一个以4千赫兹刺激并以每秒18,000帧记录的细胞。

若将细胞垂直于电场放置，则可观察并研究一种不同类型的外毛细胞反应性弯曲。例如，当该细胞在50赫兹频率下受到垂直于其长轴的电场刺激时，会发生弯曲。外毛细胞在受到非电刺激时也可表现出形态变化。

这种反应被称为慢速运动，也可通过该技术进行研究。在四种不同方案中选择不同的刺激方式。第一种是连续单频刺激。

请注意，刺激模式、频率、振幅和波形类型均可通过自制控制软件进行选择，这些参数由红色圆圈标示。第二种刺激方案为脉冲式单频刺激，其中脉冲的持续时间以及脉冲之间的间隔均可调节。第三种方案为线性扫描，其起始频率和终止频率均可调节。

第四种刺激方案是多刺激模式，可组合不同的刺激方式。在选择相应参数后，控制软件会配置系统，并允许操作者通过点击计算机屏幕上的一个按钮，启动光同步视频记录和细胞刺激。在本视频中，当分离的外毛细胞受到与其长轴平行或垂直的外部交变电场刺激时，其长度或曲率会发生变化。

使用 Pro Analyst 软件的特征追踪功能对离体毛细胞的反应进行离线分析。图中显示的是一个以 50 Hz 频率刺激并以每秒 1000 帧速度记录的离体毛细胞。该软件可逐帧提供两点之间的距离变化，如图中细胞缩短过程所示。所选两点分别位于细胞顶端（以红色标记为顶膜板）和细胞基部（以绿色标记为基极），在细胞缩短时距离较小，并随着细胞伸长而增大。该软件对离体毛细胞长度的变化进行逐帧分析。

图像底部的面板显示了运动轨迹。在此示例中，总变化长度约为 6.5 像素。此示例表明，利用 Pro Analys 软件的轮廓追踪功能，可检测细胞边缘并自动测量光学切片的面积。

在本实验中，将聚苯乙烯微球随机加入灌流溶液，并使其牢固地附着在细胞质膜上。可同时选择不同的微球，软件能够自动逐帧追踪所有微球的运动。通过这种方法，可将细胞划分为多个区域，进而独立评估每个区域的运动特性。

通过选择位于细胞侧边缘的微球，可独立评估各节段长度的变化以及一个节段相对于另一个节段的角度变化。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。

当然，对录制的视频进行离线分析还需要额外的时间。然而，借助适当的软件，每段视频的分析大约只需再花费三个小时即可完成。观看本视频后，您应能充分了解如何研究外毛细胞的运动反应，包括电致运动、慢运动以及在声频范围内的弯曲运动。