Name: 肝细胞样细胞从人类胚胎干细胞群的鲁棒代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 了解如何从人类胚胎干细胞高效分化出功能性肝细胞，该方法效率可达约90%，为肝脏生物学研究和药物毒性预测提供可靠的体外模型。

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Hay 博士获得了英国研究理事会（RCUK）研究员项目的资助，West 博士获得了外科系的资助，Medine 博士获得了英国心脏基金会核心基金的资助，Baltasar Lucendo-Villarin 先生获得了英国医学研究理事会（MRC）博士生奖学金的资助，Zhou 博士获得了中国政府奖学金的资助。

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们开发了一种简单、均一且高度可重复的 体外 用于规模化生成人源HLCs的模型。我们的模型已通过多家外部合作实验室的验证。我们 routinely 使用内部开发的一套发育标志物和肝脏特异性功能检测方法（其中大多数为商业化试剂盒）对干细胞来源的HLCs进行表征。该流程的关键步骤包括：维持干细胞的多能性；引导干细胞定向分化为定型内胚层；获得均一的肝内胚层细胞群；以及获得具有广泛功能的成熟肝内胚层细胞。 体外. 
干细胞来源的HLC技术大规模应用的一个局限性在于成熟肝内胚层在培养中分化功能的短暂性&tilde;在基质胶上培养4天）。因此，我们筛选了一个聚合物文库，以寻找具有生物活性和新颖性的细胞支撑材料。该筛选工作已帮助我们鉴定出一种新型支撑材料，可维持肝细胞功能至少15天。该技术的近期发展方向主要是在药物发现过程中实现工业化应用（Hay et al 2011）。中期来看，该技术有望用于开发人源化体外肝脏支持装置，以用于肝病患者的过渡治疗或治疗手段。从长期来看，该技术可能应用于基于细胞的肝病移植治疗，但目前的数据表明，该策略在临床安全应用前仍需大量研究...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;Matrigel 包被培养板和培养瓶 &lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt; 基质胶（Matrigel，10 mL，BD Biosciences，UK）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;KO-DMEM（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;组织培养板（6 孔，12 孔，Corning，UK） &lt;/li&gt;&lt;li&gt;组织培养瓶（25 cm² 透气，Corning，英国）&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;hESC 维持 &lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）（100 mL，R &amp;amp; D Systems，美国）；于 -20℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;BSA 溶液（50 mL，Sigma Aldrich，UK）；4 ℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;人碱性成纤维细胞生长因子（100 &amp;#x03BC;g，Peprotech，美国）；于 -20 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;使用胶原酶传代人胚胎干细胞&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;汇合的hESC培养孔或培养瓶。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;根据需要使用Matrigel包被的孔板或培养瓶。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;磷酸盐缓冲液（不含 MgCl）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；室温保存。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;胶原酶IV（1 g，Gibco，Invitrogen，英国）；4℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（MEF-CM）（100 mL，R &amp;amp; D Systems, 美国)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;人碱性成纤维细胞生长因子（100 &amp;#x03BC;g，Peprotech，美国）&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;hESC向肝内胚层的分化&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;RPMI 1640（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;B27 补充剂（10 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Activin A（2 &amp;#x03BC;g，Peprotech，美国）；于 -20 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;重组小鼠 Wnt3a (2 &amp;#x03BC;克，R &amp;amp; D Systems，美国）；于 -20℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;KO-DMEM（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;KO-SR（500 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;非必需氨基酸（100 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇（10 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；4 ℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;DMSO（Sigma Aldrich，英国）；室温保存&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Leibovitz L-15 培养基（500 mL，Sigma Aldrich，UK）；4 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;胰蛋白胨磷酸盐肉汤（100 mL，Sigma Aldrich，UK）；4 ℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;F&amp;#8211;胎牛血清，热灭活（500 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；储存于 -20&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;氢化可的松-21-半琥珀酸酯（100 mg，Sigma Aldrich，英国）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;胰岛素（牛胰腺）（100 mg，Sigma Aldrich，UK）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;L-谷氨酰胺（100 mL，Gibco，Invitrogen，英国）；储存于 -20&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;抗坏血酸（25 g，Sigma Aldrich，UK）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;人源 HGF（10 &amp;#x03BC;g，Peprotech，美国）；于 -20 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;重组人抑瘤素M（OSM）（50 &amp;#x03BC;克，R &amp;amp; D Systems，美国）；于 -20 ℃ 保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;注射器驱动滤器单元 0.22 &amp;#x03BC;m（Millipore，英国）&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;人胚胎干细胞来源的肝内胚层的表征&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;免疫染色 &lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;磷酸盐缓冲液（不含 MgCl）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)（500 mL，Gibco，Invitrogen，UK）；室温保存。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;PBST，即含0.1% TWEEN 20（Sigma-Aldrich，UK）的PBS。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，UK）用 PBS 配制，储存于 -20&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;甘油（Sigma-Aldrich，英国），室温保存。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Tris碱（Sigma-Aldrich，英国），室温保存。&lt;/li&gt;&lt;li&gt;乙醇&lt;/li&gt;&lt;li&gt;血清（AbD Serotech，英国），-20℃保存&amp;#x00B0;C.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;二抗，Alexa Fluor 荧光染料（Molecular Probes，Invitrogen，英国）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;MOWIOL 4-88（Polysciences Inc，USA）按照生产商说明书用 Tris HCl 和甘油配制。DAPI（Pierce，Thermo Fisher Scientific，UK）以1:1000稀释度加入MOWIOL溶液中。&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;一抗&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;抗原*&lt;/td&gt; &lt;td&gt;类型&lt;/td&gt; &lt;td&gt;供应商&lt;/td&gt; &lt;td&gt;稀释&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;ALB&lt;/td&gt; &lt;td&gt;小鼠单克隆&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sigma Aldrich&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1/500&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;E-钙黏蛋白&lt;/td&gt; &lt;td&gt;小鼠单克隆&lt;/td&gt; &lt;td&gt;默克密理博&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1/100&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&amp;alpha;甲胎蛋白&lt;/td&gt; &lt;td&gt;小鼠单克隆&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Sigma&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1/500&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;SSEA-4 FITC&lt;/td&gt; &lt;td&gt;小鼠单克隆&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Biolegend&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1/100&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;IgG&lt;/td&gt; &lt;td&gt;小鼠单克隆&lt;/td&gt; &lt;td&gt;DAKO&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1/500&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td colspan=&quot;2&quot;&gt;二抗&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;抗小鼠 FITC 偶联物&lt;/td&gt; &lt;td&gt;山羊单克隆&lt;/td&gt; &lt;td&gt;Invitrogen&lt;/td&gt; &lt;td&gt;1/400&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt;&lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表2.&lt;/strong&gt; 用于hESC来源的肝内胚层免疫染色的抗体、使用浓度、宿主物种及购买公司。&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;肝内胚层功能分析及标准化（按每毫克蛋白质计）&lt;/p&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;细胞色素P450测定&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;p4-GLO CYP3A4、CYP1A2、试剂盒和 luminometer（Promega，USA）&lt;/li&gt;&lt;li value=&quot;1&quot;&gt;白色平底96孔检测板（BD Biosciences，英国）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;BCA 测定试剂盒（Pierce，Thermo Fisher Scientific，英国）&lt;/li&gt;&lt;li&gt;透明96孔检测板（IWAKI，英国）&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

尽管在模拟人类药物毒性方面已取得进展，但由于不可预知的副作用，许多化合物在临床试验中仍会失败。临床研究的成本十分高昂，因此在药物开发早期开发并应用更具预测性的毒理学筛选方法至关重要（Greenhough 等，2010）。人肝细胞是目前评估药物毒性的金标准模型，但其资源有限且功能存在变异性。因此，由于永生化细胞系和动物组织模型来源丰富，常被常规使用。尽管这两种来源均能提供一定信息，但其应用受限于功能较差、物种差异和/或在培养中不稳定等问题（Dalgetty 等，2009）。多能干细胞（PSCs）是获得类人肝细胞（HLCs）的一种有吸引力的替代来源（Medine 等，2010）。PSCs 具有自我更新能力，并可分化为成体中存在的所有体细胞类型，因而代表了一种潜在无限的分化细胞来源。我们已开发出一种简单、高效、易于自动化且能产生功能性人源 HLCs 的方法（Hay 等，2008；Fletcher 等，2008；Hannoun 等，2010；Payne 等，2011 和 Hay 等，2011）。我们相信，该技术将推动 HLCs 在药物发现、疾病建模、体外装置构建以及可能的细胞移植治疗中的规模化生产。

本文将重点介绍如何从人类胚胎干细胞群体中生成人类肝内胚层细胞。

尽管在模拟人类药物毒性方面已取得进展，但由于无法预测的副作用，许多化合物在临床试验期间仍会失败。临床研究的成本十分高昂，因此在药物开发早期建立并应用更具预测性的毒理学筛选方法至关重要（Greenhough 等，2010）。目前，人肝细胞是评估药物毒性的金标准模型，但其来源有限且功能存在变异性。因此，研究中通常采用永生化细胞系和动物组织模型，因其来源更为广泛。尽管这两种模型均具有一定参考价值，但其应用受限于功能较差、物种差异和/或体外培养中的不稳定性（Dalgetty 等，2009）。多能干细胞（PSCs）是获得类人肝细胞（HLCs）的一种理想替代来源（Medine 等，2010）。PSCs 具有自我更新能力，并可分化为成体中存在的所有体细胞类型，因而代表了一种潜在的无限细胞来源。我们已开发出一种简便、高效、适用于自动化操作并能产生功能性人源 HLCs 的技术流程（Hay 等，2008；Fletcher 等，2008；Hannoun 等，2010；Payne 等，2011；Hay 等，2011）。我们相信，该技术将推动 HLCs 在药物发现、疾病建模、体外装置构建以及可能的细胞移植治疗中的规模化应用。

以下实验的总体目标是生成均一水平的人类肝细胞，以在体外研究人类肝脏生物学。该过程首先利用在 A 和 WINT 三个 A 中具有活性的生理刺激，诱导人类胚胎干细胞（human ESCs）向定型内胚层分化。第二步是高效地将定型内胚层进一步诱导为肝内胚层。随后，将来源于人类胚胎干细胞的肝内胚层在体外成熟，以生成具有功能的人类肝细胞。PCR、Western印迹、免疫荧光、ELISA以及药物代谢的结果表明，该方法可将人胚胎干细胞（ESCs）分化为肝细胞，效率约为90%。利用该技术，理论上我们可以无限量地生成具有显著人肝脏功能的原代人肝细胞。未来，这将有助于准确预测药物毒性，并提供人肝脏支持功能。关键在于驱动定向分化以及实现人细胞的核心密度。该方法的可视化演示至关重要，因为核心细胞密度对于获得均一的细胞群体必不可少。我们已在四个国际地点培训了15名以上人员，使其成功掌握该技术。实验起始使用人胚胎干细胞培养物，并在基质胶包被的培养板中，采用添加了基础成纤维细胞生长因子（bFGF）的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（ORM cm）进行传代培养。在进行肝向分化之前，必须对维持培养的人胚胎干细胞进行仔细的表征。例如，这些细胞具有人胚胎干细胞的典型形态，并且表达多能干细胞标志物OCT4和Nanog，其表达水平与阳性对照H7人胚胎干细胞系相当。此外，人胚胎干细胞对 SSEA-4 呈阳性。当人胚胎干细胞汇合度达到 30% 至 60% 时，用新配制的分化培养基替换 mTeSR1 培养基。为启动肝向分化，培养基应每 24 小时更换一次，持续三天。三天后，细胞开始向内胚层表型分化，呈现三角形外观。将培养基更换为SR DMSO分化培养基，继续培养4至5天。每48小时更换一次培养基。经过这一五天周期后，细胞将开始呈现肝细胞特征性的多边形形态。至第9天，人胚胎干细胞向肝内胚层的分化通过一系列显著的形态学变化得以体现。此外，在为期九天的时间过程中，Octa four 的表达量逐渐下降。相比之下，甲胎蛋白（a FP）和白蛋白的肝脏转录本从第七天开始增加。随后，将细胞在终末培养基中继续成熟，并维持肝细胞表型九天，每 48 小时更换一次新鲜培养基。最后，通过相差显微镜监测培养的细胞，观察其形态是否逐渐从尖锐的三角形转变为具有多边形外观的典型肝脏形态，以定量评估肝内胚层功能。对于细胞色素P450酶活性，特别是CYP3A4或CYP1A2，首先将第17天的细胞进行孵育。将人胚胎干细胞来源的肝内胚层细胞与特定底物共同孵育，每组设三个重复。请记住使用组织培养基作为阴性对照，在37摄氏度下孵育五小时。收集上清液，并根据制造商说明书详细步骤测定基础酶活性的相对水平。现在，针对每个样本，根据A-B-C-A-S法测定的每毫克蛋白质的酶活性进行计算。通过该体外成熟肝内胚层方法获得的典型培养物进行免疫染色，结果显示三种人类肝脏标志物——白蛋白、甲胎蛋白（a FP）和ein——呈均一表达。观看本视频后，您应能充分理解如何高效地将人多能干细胞分化为肝细胞。一旦掌握该技术，便可每天进行操作，每百万细胞仅需投入约两分半钟。在分化过程中，每天观察细胞形态变化至关重要。

robust-generation-hepatocyte-like-cells-from-human-embryonic-stem

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肝细胞样细胞从人类胚胎干细胞群的鲁棒代

本文将重点介绍用于干细胞来源的人肝细胞长期稳定培养的聚合物包被表面的开发。...

利用优化的合成表面稳定肝细胞表型

本文介绍了一种可扩展且符合优良生产规范（GMP）的人多能干细胞向肝细胞样细胞分化的体系。该体系为开展基础和应用型人类肝脏研究提供了成本效益高且标准化的人肝细胞样细胞制备方法。...

由人多能干细胞定义明确且可扩展地生成肝细胞样细胞

本文所述方案介绍了一个用于发现治疗肝病小分子的平台。逐步详细描述了如何在96孔板中将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有肝细胞特征的细胞，并利用这些细胞筛选具有潜在治疗活性的小分子。...

利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

本方案描述了一种在96孔板体系中由人多能干细胞生成肝细胞样细胞的半自动化方法。该过程快速且成本效益高，可用于生产质量可控的肝细胞样细胞批次，服务于基础和应用型人类研究。...

多能干细胞向类肝细胞的半自动化生产

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

本文旨在提供一种标准化的方法，以诱导人多能干细胞分化为肝祖细胞。该实验流程结合即用型培养基配方，为用户提供了便捷的系统，可用于生成人肝细胞，服务于生物医学研究及转化应用。...

利用定义明确的分化系统从多能干细胞诱导肝祖细胞分化

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin...

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

本文介绍一种非遗传学方法，利用从稳态外周血中分离的单个核细胞生成人自体肝类球体。...

用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

现有的多能干细胞（PSC）向功能性细胞分化的体系目前受到严重的细胞系间和批次间变异性的阻碍。本文以心肌细胞分化为主要示例，介绍了一种基于图像的机器学习方法，用于智能监测和调控PSC分化过程的实验方案。...

一种基于活细胞成像的机器学习策略用于监测多能干细胞分化

了解如何从人类胚胎干细胞高效分化出功能性肝细胞，该方法效率可达约90%，为肝脏生物学研究和药物毒性预测提供可靠的体外模型。

从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

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