Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

以下实验的总体目标是产生均匀水平的人肝细胞，以在体外研究人类肝脏生物学。这是通过使用在 A 和 WINT 中激活的生理刺激将人胚胎干细胞或人 ESC 驱动到确定的内胚层来启动的，A.As 第二步，确定的内胚层被高效地驱动到肝内胚层。接下来，人 ESC 衍生的肝内胚层在体外成熟以产生功能性人肝细胞。

PCR Western blotting、免疫荧光、Eliza's 和药物代谢的结果表明，该方法以约 90% 的效率从人 ESC 中提取肝细胞使用这项技术，理论上我们可以产生取之不尽的原代人肝细胞供应，这些肝细胞表现出相当水平的人类肝功能。未来，这将有利于准确预测药物毒性并提供人类肝脏支持。诀窍是驱动太阳分化和人体细胞的核心密度。

这种方法的视觉演示至关重要，因为核心细胞密度对于产生均匀的细胞群至关重要。我们已经在国际四个地点培训了超过 15 人，以成功执行这项技术。从人胚胎干细胞的培养开始，并在基质胶包被的平板上增殖，其中含有补充有碱性 FGF 的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基 ORM cm。

仔细表征肝分化前维持的人 ESC 很重要。例如，这些细胞表现出人类 ESC 形态。它们还表达多能干细胞标志物 OCT four 和 nano，其水平与阳性对照 H 7 人 ESC 系相当。

此外，人类 ESC 对 SS EEA 4 呈阳性。当人 E ESC 达到 30% 至 60% 的共流畅度时，用新鲜制备的分化培养基替换 ME CM。为了开始肝分化，应每 24 小时更换一次培养基，持续 3 天。

三天后，细胞呈现三角形外观，开始向内胚层表型分化。将培养基切换到 SR DMSO 分化。培养基培养 4 至 5 天。

每 48 小时更换一次培养基。在这 5 天之后，细胞将开始呈现出肝细胞特有的多边形外观。人 ESC 向肝内胚层的分化反映在第 9 天时一系列深刻的形态变化中。

此外，Octa 4 在 9 天的时间过程中的表达逐渐降低。相比之下，FP 和白蛋白的肝脏转录物从第 7 天开始增加。继续使细胞成熟并在最终培养基中保持肝脏表型，每 48 小时用新鲜培养基维持 9 天。

最后，通过相差显微镜监测培养细胞的形态变化，从尖刺的三角形逐渐变为显示多边形外观的特征性肝脏形态，以定量评估肝内胚层功能测定。对于细胞色素 P 4 50 酶活性，特别是 SIP 3 A 4 或 SIP 1 A 2。第一次孵化 17.

具有特定底物的人 ESC 衍生的肝内胚层细胞一式三份进行反应。请记住使用组织培养基作为阴性对照，在 37 摄氏度下孵育 5 小时。收集上清液并按照制造商的说明中详细说明测量基础酶活性的相对水平。

现在，对于每个样品，计算由 A-B-C-A-S 测定的每毫克蛋白质的酶活性。通过这种肝内胚层体外成熟方法得出的典型培养物的免疫染色。证明三种人肝脏标志物白蛋白 a FP 和 ein 的均一表达。

看完这个视频后，你应该对如何有效地将人类干细胞和学习干细胞分化为肝细胞有了很好的了解。一旦掌握了这项技术，就可以每天进行一次，承诺每百万个细胞大约两分半钟。在分化过程中，每天检查形态变化非常重要。