一种高通量自动化的平台，制造蛋白质治疗的细胞系发展
September 22nd, 2011
描述的是一种高通量，自动化平台生产蛋白质药物的制造细胞系的发展。 BD流式细胞仪咏叹调细胞分选的实施，CloneSelect成像和TECAN自由EVO液体处理系统已显示出显着增加细胞系的发展与提高细胞的质量和高重现性的加工能力。
该程序的总体目标是开发具有克隆性和高生产率的生物制剂生产细胞系。这是通过首先用 DNA 对宿主细胞进行横切来实现的，DNA 编码目标基因。该程序的下一步是通过事实分离高产克隆，然后通过克隆选择成像仪记录菌落形成。
最后一步是筛选和选择高产克隆。最终，可以获得结果，显示通过反相 HPLC 在连续和补料分批培养物中产生抗体。视频。该方法的演示至关重要，因为事实上分选和 pcan 80 dgl 步骤很难学习，因为这些程序涉及复杂的设置，以下来自实验室的科学家将演示这些转染宿主细胞效应的程序，分选 Jason Sanders 用于记录菌落形成，Russell Kan 用于 tecan 采样。
和 Eliza 为了在转染前一天开始此程序，将宿主细胞以 15 mL 的生长剂量接种在细胞培养瓶中。中等。第二天在 37 摄氏度、7.5% 二氧化碳培养箱中孵育细胞，首先制备转染复合物，在 800 微升无血清的生长培养基中制备 DNA，在无菌微量离心管中轻轻混合。接下来，在聚苯乙烯管中用 800 μL 不含血清的生长培养基稀释 40 μL 唇部。
将稀释的 DNA 添加到稀释的 Lipofectamine 中。轻轻混匀并在室温下孵育 30 分钟，以制备用于转染的宿主细胞。从细胞中取出生长培养基，并替换为 6.4 mL 不含血清的生长培养基。
向培养瓶中加入 1.6 mL 转染复合物。摇动培养瓶轻轻混合。将细胞在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育 6 小时。
6 小时后，向培养瓶中加入 8 mL 生长培养基，并于第二天在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育过夜。通过抽吸去除培养基，并向培养瓶中加入新鲜的生长培养基。过夜孵育后，再次将细胞孵育过夜。
将生长培养基替换为选区。中等。将细胞在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育 2 到 3 周。转染后 2 到 3 周，通过流式细胞术活化细胞，将脱落的细胞从培养瓶中分选，并在 4 摄氏度下以 800 RPM 离心 5 分钟，即可对细胞进行克隆。
将细胞重悬于补充有 2% 牛血清白蛋白的选择培养基中。然后添加荧光标记的抗人 IgG 抗体。加入 1 至 20 的稀释液，在冰上孵育 15 至 30 分钟，然后用冷 PBS 洗涤两次，将细胞重悬于聚丙烯管中的一个 XPBS 中。
下图中显示了染色细胞的一个例子，用于在 BD 传真上进行无菌分选，准备一个 96 孔细胞培养板，每个孔中含有 200 微升选择培养基。在无菌条件下将细胞加载到试管中并分析 BD 事实。Aria，分别记录染色细胞和未染色细胞的结果。
设置门和设置，将所需荧光染色曲线的单个细胞分选到 96 孔板中，在第 0 天、第 3 天、第 7 天和第 13 天将板在 37 摄氏度培养箱中孵育两周，分选后在 Clone Select 成像仪上的 96 孔板中记录集落形成，以确保选择来自单个细胞的克隆进行筛选和选择以实现高生产率克隆。首先记录接收 96 孔分析板中的样品位置。然后使用机器人液体处理系统将 20 μL 上清液等分试样转移到 96 孔测定板的每个孔中，通过夹心分析样品中产生的抗体。
人 IgG 在液体处理系统上检测 ELI SA 的方法如下。首先，将样品和标准品加载到预编码的生物外壳抗人 IgG 检测板上。将板在室温下孵育 2 小时，然后进行 3 次 PBS 洗涤。
接下来 immuno 纯山羊抗人 IgG。将 HRP 以 1 至 2000 的稀释度添加到板中，并将板在室温下孵育 1 小时。一小时后，用 PBS 洗涤板 3 次，然后加入 A BTS 底物。
最后，使用 405 纳米的吸光度在读板器上将板标记为红色以进行检测。使用这个自动化平台，发现用荧光标记的抗人 IgG 染色所反映的表面抗体水平与细胞的抗体产能相关。如此处所示，对于从具有高表面抗体表达的细胞群生成的前两个克隆，比生产率范围为每天每个细胞 50 至 70 pg。
相比之下，对于表面抗体表达低的细胞群产生的前两个克隆，抗体生产率约为每天每个细胞 20 pg。此外，通过事实分选开发的细胞系比通过手动限制稀释克隆的细胞系在抗体生产方面更稳定。通过手动限制稀释产生的顶部克隆克隆的比产率在培养 80 次细胞倍增后从大约 30 个 PCD 下降到大约 10 个 PCD。
另一方面，通过传真分拣克隆 2 生成的顶部子克隆能够在至少 100 个单元倍增中保持 20 PCD 左右的特定生产率。通过荧光原位杂交鉴定细胞染色体中的转基因整合位点表明，克隆 1 是表型 A 和表型 B.In 的混合群体，相比之下，分选克隆似乎是一个更均匀的群体，具有 99.5% 的表型 A 细胞。
概述
本文介绍了一个用于开发细胞系以生产蛋白质治疗药物的高通量、自动化平台。先进技术的实施显著提高了细胞系开发的处理能力和可重复性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞系开发
- 蛋白质治疗药物生产
- 高通量筛选
背景
- 目标是开发具有高克隆性和生产力的制造细胞系。
- 用编码感兴趣基因的DNA转染宿主细胞是第一步。
- 通过流式细胞术分离高产克隆。
- 使用成像技术记录菌落形成。
研究目的
- 展示用于开发治疗蛋白细胞系的自动化方法。
- 提高细胞系开发的效率和质量。
- 展示使用先进分选和成像技术的优势。
使用的方法
- 用DNA和脂质体转染宿主细胞。
- 用于分选高产克隆的流式细胞术。
- 使用克隆选择成像仪记录菌落形成。
- 通过ELISA分析抗体生产。
主要结果
- 表面抗体水平与抗体产能相关。
- 通过分选开发的细胞系比通过手动稀释开发的细胞系更稳定。
- 克隆的特定产能根据分选方法有显著差异。
- 荧光原位杂交显示种群均一性的差异。
结论
- 自动化平台提高了细胞系开发的效率。
- 高通量方法带来了更好的质量和可重复性。
- 分选技术改善了细胞系的稳定性和产能。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput, automated cell line development platforms are critical for accelerating the production of protein therapeutics in biopharma pipelines. This integrated workflow enhances predictive confidence in clone selection, reduces operator error, and supports rapid portfolio advancement. The approach directly addresses the industry's need for scalable, reproducible, and traceable manufacturing cell lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of host cell productivity and stability for biologic manufacturing.
- Supports functional validation of transgene expression and integration in production hosts.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating surface antibody levels with productivity.
- Improves predictive confidence in selecting high-yielding, stable clones for further development.
Screening & Assay Development
- Automates preparation and screening of thousands of clones per cycle for quantitative productivity assessment.
- Standardizes ELISA-based productivity measurements using robotic liquid handling for reproducibility.
- Enables high-throughput, fluorescence-based selection of top-producing clones via flow cytometry.
- Provides electronic documentation and traceability of clone history for compliance and reuse.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from cell line selection to preclinical protein production for therapeutic candidates.
- Aligns clone selection with downstream manufacturing and analytical requirements.
- Reduces risk of late-stage failure by ensuring stability and homogeneity of production cell lines.
Pipeline & Workflow Integration
This automated platform bridges early discovery, screening, and preclinical manufacturing by integrating transfection, clone selection, and productivity analytics into a unified workflow.
- Discovery Biology: Provides quantitative, fluorescence-based readouts for hypothesis testing and clone prioritization.
- Screening: Delivers high-throughput, reproducible productivity data to inform go/no-go decisions.
- Analytics: Enables direct comparison of clone performance using ELISA and imaging outputs.
- Translational Research: Ensures selected clones meet stability and productivity thresholds for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform adaptable to various protein therapeutics and host systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in clone selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in cell line development.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by minimizing manual error.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biologic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, imaging, and automated liquid handling systems.
- Demands access to integrated instrumentation and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and data management.
- Adaptable to different host cell systems and protein modalities with appropriate probe selection.
- Throughput and scalability are limited by instrumentation capacity and assay design.
