用于蛋白治疗药物生产细胞系开发的高通量自动化平台

本实验的总体目标是开发具有单克隆性和高表达量的生物制剂生产用细胞系。首先通过将编码目的基因的DNA转染宿主细胞来实现这一目标。接下来的步骤是利用流式细胞分选技术分离高表达克隆，随后使用克隆筛选成像仪对克隆的菌落形成进行记录和验证。

最后一步是筛选并选择高表达的克隆。最终可获得结果显示在连续培养和补料分批培养中通过反相高效液相色谱法（HPLC）进行抗体生产。视频。该方法的演示至关重要，因为分选和pCan 80 DGL步骤由于涉及复杂的实验装置而难以掌握，以下实验室科研人员将演示相关操作流程：Jason Sanders 负责宿主细胞转染效果的演示及菌落形成记录，Russell Kan 负责Tecan取样操作。

以及Eliza，在转染前一天开始此操作，将宿主细胞以15毫升培养基接种于细胞培养瓶中。将细胞在37摄氏度、7.5%二氧化碳的培养箱中孵育。次日，首先制备转染复合物：在无菌微量离心管中，将8微克DNA溶于800微升无血清的培养基中，轻轻混匀。接着，在聚苯乙烯管中，将40微升Lip溶于800微升无血清的培养基中。

将稀释后的DNA加入稀释后的Lipofectamine中，轻轻混匀，在室温下孵育30分钟，以准备用于转染的宿主细胞。移除细胞中的培养基，并更换为6.4毫升无血清的培养基。

向培养瓶中加入1.6毫升转染复合物。轻轻摇动培养瓶以混匀。将细胞在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育6小时。

六小时后，向烧瓶中加入八毫升培养基，于37摄氏度二氧化碳培养箱中孵育过夜。次日，吸除培养基，向烧瓶中加入新鲜培养基。过夜孵育后，再次将细胞继续孵育过夜。

将生长培养基更换为筛选培养基。将细胞置于37°C的二氧化碳培养箱中孵育2至3周。转染后2至3周，细胞可用于克隆，通过流式细胞术激活细胞分选，从培养瓶中分离细胞，并在4°C下以800转/分钟离心5分钟。

将细胞重悬于添加了2%牛血清白蛋白的筛选培养基中。然后加入荧光标记的抗人IgG抗体，按1:20稀释，冰上孵育15至30分钟，随后用冷的PBS洗涤两次，最后将细胞重悬于聚丙烯管中的1×PBS中。

此图片显示了在BD FACS Aria上进行无菌分选的染色细胞示例。准备一块96孔细胞培养板，每孔含有200 µL筛选培养基。将细胞悬液无菌装入试管中，并在BD FACS Aria上进行分析，分别记录染色细胞与未染色细胞的结果。

设置分选门和参数，将具有目标荧光染色特征的单细胞分选至96孔板中，将该板置于37摄氏度培养箱中孵育两周。在分选后的第0天、第3天、第7天和第13天，使用Clone Select成像仪记录96孔板中的克隆形成情况，以确保所选克隆来源于单个细胞，进而筛选并挑选高产克隆。首先记录样本在接收用96孔检测板中的位置，随后使用自动化液体处理系统将20 µL上清液等分转移至96孔检测板的各个孔中，通过夹心法分析样品中的抗体产量。

在液体处理系统上采用以下方法进行人IgG检测ELISA。首先，将样本和标准品加入预编码的生物涂层抗人IgG检测板中。板在室温下孵育两小时，随后用PBS洗涤三次。

随后将免疫纯化的山羊抗人 IgG-HRP 以 1:2000 的比例稀释后加入板孔中，并在室温下孵育一小时。一小时后，用 PBS 洗涤板孔三次，然后加入 A BTS 底物。

最后，使用酶标仪在405纳米波长处通过吸光度检测对平板进行读数。利用该自动化平台发现，荧光标记的抗人IgG染色所反映的细胞表面抗体水平与细胞的抗体生产能力相关。如图所示，从表面抗体表达水平较高的细胞群体中筛选出的两个最佳克隆，其比生产率范围为每天每细胞50至70皮克。

相比之下，由表面抗体表达水平较低的细胞群体产生的前两个克隆，其抗体生产率约为每天每细胞20皮克。此外，通过流式分选技术建立的细胞系在抗体生产稳定性方面优于通过手动有限稀释法克隆获得的细胞系。通过手动有限稀释法获得的最佳克隆（克隆1）的特异性生产率在培养经历80次细胞倍增后，从大约30 PCD下降至大约10 PCD。

另一方面，通过流式分选获得的顶级亚克隆（来自克隆二）能够维持约每细胞每天20 pg的比生产率，至少持续100次细胞倍增。通过荧光原位杂交鉴定外源基因在细胞染色体中的整合位点表明，克隆一为表型A与表型B的混合群体。相比之下，经流式分选获得的克隆则表现出更高的均一性，其中99.5%的细胞为表型A。观看本视频后，您应能充分理解如何开发用于生产治疗性蛋白质的生产工艺用细胞系。