小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

本实验的总体目标是在小鼠胚胎中枢神经系统的特定发育时期和脑区实现高效的基因转染。首先，需要制备精密的毛细管和针状电极，以避免对子宫造成损伤。实验的第二步是学习一种独特的胚胎固定方法，利用光纤电缆照亮以清晰观察微小胚胎，从而实现靶向DNA注射。

该操作的第三步是使用棒状电极对子宫表面进行电穿孔，以将DNA转染至大脑的浅层区域；操作的最后一步是使用针状电极对大脑深部结构（如丘脑和下丘脑）进行电穿孔。最终可获得显示皮质层、特定区域转染或丘脑高效转染的结果。该技术相较于现有的常规中性植入等方法，主要优势在于能够更清晰地观察并更精确地控制子宫内胚胎的植入位点。

我们使用一种类似光纤的电缆，能够对 E 9.5 胚胎及通过针状电极将质粒 DNA 导入大脑深部区域（如丘脑和下丘脑）进行可视化操作。该方法有助于回答关于发育中大脑的关键问题，例如神经元分化、脑区模式形成以及神经连接。通常，初次接触该方法的研究者会面临困难，原因在于针头塑形、电极制作以及精确定位均具有较高技术难度。

子宫和胚胎。该方法的可视化演示对于掌握如何精确制备针电极以及如何放置胚胎以进行电穿孔至关重要，因为这两个步骤是实验成功的关键。制备毛细管时，应按照制造商的说明使用微量移液器拉制仪。

在此操作中，我们使用内无纤维的1毫米玻璃毛细管。用解剖显微镜和镊子将拉制的针尖夹断，使针尖末端外径小于60微米，并确保从尖端起长度为800微米至1毫米，最终针尖开口直径为20至30微米。使用测微计测量每根针。

接下来，通过缠绕法制备微电极。将钨丝的一端缠绕在镀金针上。使用钨丝作为负极，铂丝作为正极。

用参数将导线固定在针脚上。然后将导线插入棉签的塑料杆中，并用菲姆（phim）均匀地包裹两端。用细砂纸将导线尖端磨至尖锐，使其尖端直径达到20至30微米，且在距尖端800微米至1毫米处的直径为60微米。再次使用千分尺检查最终尺寸。

接下来，将磨细的金属丝浸入一滴指甲油中，使金属丝表面均匀覆盖一层薄薄的绝缘涂层。待指甲油干燥后，使用蘸有丙酮的棉签擦去尖端最后200微米处的指甲油。铂电极可直接购买成品，无需额外制备。

在此实验步骤中，我们使用 CUY 六 10 P 四-一 nepo 基因电极，通过大提或等效方法纯化质粒 DNA，将 100 微克 DNA 转移至新离心管中，并加入 10 微升 1% 快绿染料。用 TE 缓冲液将体积调至 100 微升，使最终质粒 DNA 浓度为 1 微克/微升。通过移液轻轻混匀溶液，然后在室温下以 14,000 RPM 离心 5 分钟，以去除杂质和盐分。

将SNAT转移至新离心管中。在整个操作过程中，DNA溶液可保存在离心管中并置于室温下。接下来，根据制造商说明书，将拉制好的针头连接至显微操作器，将针头尖端浸入DNA溶液中，以充满针头。

小心地将显微操作仪移至一旁，并在手术前准备好手术器械。在胚胎发育第9.5至15.5天期间称量怀孕小鼠的体重，以确定其体质量。

随后进行腹腔注射。按每克体重50微克的剂量注射药用级戊巴比妥钠，注射后观察五分钟。戊巴比妥钠的替代药物可包括氯胺酮、赛拉嗪、速眠新或气体麻醉剂。

麻醉后，使用剃须刀片和50%乙醇去除腹部的毛发。用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭皮肤进行消毒。用精细剪刀在腹部正中线做一切口。

小心地将所有子宫角拉出，并置于围绕伤口放置的、经一倍磷酸盐缓冲液（PBS）润湿的棉纱布上。始终用PBS保持子宫湿润。使用柔性光纤电缆。

将导线置于子宫角下方。将子宫置于光纤光源与拇指之间，轻轻挤压，使胚胎向子宫壁方向上移。当胚胎头部位于左侧且朝上时，小心将玻璃毛细管插入目标脑室，于胚胎发育第13.5天时注入约一微升DNA溶液，用于皮层第四层的电穿孔。

将铂丝电极置于子宫外，使用 38 伏特电压、50 毫秒脉冲时长的方波电流脉冲刺激五次。若在胚胎第 10.5 天通过微电穿孔靶向丘脑或下丘脑，则将细钨丝负极插入已注射 DNA 的脑室，铂丝正极插入子宫。使靶区域位于两电极末端之间，并以 7 伏特电压、100 毫秒脉冲时长的方波电流脉冲刺激三次。

电穿孔完成后，将子宫角恢复至原始位置，并加入 500 µL PBS。使用手术缝线缝合切口的内层，然后用 9 mm 自动夹闭器闭合外层。

将小鼠置于加热垫上两小时，以促进其从手术和麻醉中恢复。此处显示的是在胚胎第13.5天、14.5天和15.5天对皮层区域进行的铂金电穿孔操作。脑组织于出生后采集。

第六天。每次实验中发生电穿孔的皮层细胞层明显不同。这表明，时间依赖性的电穿孔使得皮层各层的特异性功能获得和功能缺失成为可能。

如图所示，对丘脑和下丘脑等深层组织进行电穿孔。使用铂金丝电极通常效率较低，而采用微电极进行电转染则对这些深层组织具有更高的效率和更好的细胞存活率。

我们将血浆DNA溶液注入小鼠胚胎的第三脑室。在胚胎发育第11.5天，我们对丘脑进行针式电穿孔，大部分丘脑外显子在出生后第六天投射至大脑皮层。在此，我们展示了P-C-A-G-E-Y-F-P微电穿孔技术在发育中头部的应用。

通过RORC标记所有丘脑后有丝分裂神经元，显示了丘脑区域。白色箭头所示的轴突投射至大脑皮层第四层，可通过EYFP可视化，EYFP可填充整个神经元。RORC抗体也标记了大脑皮层第四层的位置。

一旦开始进行MA，若操作得当，每升样品可在15分钟内完成该技术。在进行此操作时，必须注意小心处理待测样品，以防造成任何损伤。遵循本操作步骤后，还可采用其他方法，例如将特定染料掺入线粒体DNA，以研究细胞发育后细胞特化的分子机制。

该技术为中枢神经系统发育领域的研究人员探索图式形成、轴突生长和环路构建中的分子机制提供了有力工具。