在子宫内电穿孔:鼠标控制时空基因Transefection

该程序的总体目标是在胚胎小鼠中枢神经系统中所需的发育时间点和大脑区域获得有效的基因转染。首先通过准备精密毛细管和针状电极来实现，以防止子宫损伤。该程序的第二步是学习一种独特的胚胎固定方法，使用光纤光缆可视化小胚胎以进行靶向 DNA 注射。

该程序的第三步是在子宫表面使用棒状电极进行电穿孔，以便将 DNA 转染到大脑的浅表部分，该程序的最后一步是使用针型电极进行电穿孔到大脑的更深结构中，例如丘脑和下丘脑。最终，可以获得显示丘脑皮质层、特异性转染或高效转染的结果。与现有的混乱（如常规）相比，这种技术的主要优点是可以更好地观察和控制子宫中胚胎的放置部位。

我们使用类似电缆的光纤，这使得从 E 9.5 和针状体下部可视化胚胎成为可能，从而将质粒 DNA 传输到大脑的更深处，例如丘脑和下丘脑。这种方法可以帮助回答有关发育中的大脑的关键问题，例如神经元分化、大脑模式、神经连接。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为很难塑造针、电路和集体位置。

子宫和胚胎这种方法的视觉演示对于了解如何制作精确的针状电极以及如何将胚胎定位为无电至关重要。因为这两个步骤是成功的关键。要制备毛细管，请根据制造商的说明使用微量移液器拉拔器。

在这个过程中，我们使用一根没有内部纤维的毫米玻璃毛细管。拉出的针头应使用解剖显微镜测量距尖端 800 微米至 1 毫米，外径小于 60 微米，镊子将针尖夹至 20 至 30 微米的直径。使用千分尺测量每根针。

接下来，通过卷绕准备微电极。钨丝的一端围绕镀金引脚。负极使用钨丝，正极使用铂丝。

使用 param 将 wire 固定到 pin 上。然后将电线插入棉签的塑料杆中，用 phim 包裹两端，用细砂纸均匀磨尖，直到尖端达到 20 至 30 微米，在 800 微米至 1 毫米之间达到 60 微米距尖端。同样，用千分尺检查最终尺寸。

接下来，将削尖的电线浸入一滴指甲油中，在整根电线上涂上一层薄薄的涂层以进行绝缘。指甲油干燥后，使用丙酮棉签将其从尖头棒的最后 200 微米处去除。铂电极是预制的，无需准备。

在此过程中，我们使用 CUY 六个 10 P 四破折号一个 nepo 基因电极 用 maxi prep 或等效方法纯化血浆 DNA，将 100 微克 DNA 注入新管中，并加入 10 微升 1% 固绿染料。使用 TE 使体积达到 100 μL，最终达到每 μL 血浆 DNA 浓度 1 μg。通过移液头轻轻混合溶液，然后在 14， 000 RPM 室温下旋转 DNA 溶液 5 分钟，以去除杂质和盐分。

将 SNAT 转移到新试管中。在整个过程中，DNA 溶液可以在室温下保存在试管中。接下来，根据制造商的说明将拉出的针头连接到微型纵器上，将针头尖端浸入 DNA 溶液中以填充针头。

小心地将微型作器放在一边，并在手术前为手术做准备。在胚胎期称量怀孕的小鼠。9.5 到 15.5 来确定体重。

然后腹膜内。以每克体重 50 微克和体重注射医药级戊巴比妥钠，持续 5 分钟。戊巴比妥钠的替代品可能包括氯胺酮、甲苯噻嗪、喷射或气体麻醉剂。

麻醉后，使用剃须刀片和 50% 乙醇剃掉腹部的毛发。用 Betadine 和 70% 酒精的交替磨砂膏准备皮肤。用细剪刀在腹部中线切开。

小心地将所有子宫角拉出，放在伤口周围的 A one x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS 湿棉布上。始终用 PBS 保持子宫湿润。使用柔性光纤电缆。

将电缆放在子宫角下方。将子宫放在光纤灯和拇指之间，轻轻挤压以将胚胎推高，使其更靠近子宫壁。当胚胎头部左侧朝上时，小心地将玻璃毛细管插入目标心室，并在胚胎第 13.5 天注入大约 1 微升 DNA 溶液用于皮质层 4 的电穿孔。

将棒状铂电极放在子宫外，使用 38 伏特施加方波电流脉冲 5 次，持续 50 毫秒。如果在胚胎第 10.5 天使用微电穿孔到达丘脑或下丘脑，请将细钨负极插入 DNA 注入的脑室，将铂正极插入子宫。将目标区域放在两个电极的两端之间，并以 7 伏特施加建议的方波电流脉冲 3 次，持续 100 毫秒。

电穿孔完成后，将子宫角放回其原始位置并加入 500 微升 PBS。用手术缝合线缝合切口内层。然后用 9 毫米的自动夹子闭合外层。

将鼠标放在加热垫上两个小时，以便从手术和麻醉棒中恢复。这里可以看到皮质区域的铂电穿孔应用于胚胎期 13.5、14.5 和 15.5。大脑是在产后收获的。

第六天。在每个实验中，电穿孔的皮质细胞层明显不同。表明时间依赖性电穿孔使皮质层特异性功能增益和功能丧失成为可能。

如图所示，电穿孔到深部组织，如丘脑和下丘脑。使用棒状铂电极通常效率低下，使用微电极进行电作。这些深层组织提供了更好的效率和活力。

我们将血浆 DNA 溶液注射到小鼠胚胎的第三脑室中。在胚胎第 11.5 天，我们应用了仅限于丘脑的针头电穿孔，大多数丘脑外显子在出生后第 6 天投射到皮层中。在这里，我们展示了 P-C-A-G-E-Y-F-P 微电穿孔进入发育中的头颅。

丘脑区域由 RORC 显示，它标记所有丘脑有丝分裂后神经元。用白色箭头显示的轴突投射到皮层的第四层，也可以通过 EYFP 可视化，它填满了整个神经元。皮层中第 4 层的位置也由 RORC 抗体标记。

一旦 MA 开始，如果执行得当，这项技术可以在每升 15 分钟内完成。在尝试此过程时，请务必记住非常小心地处理您的测试，以防止任何损坏遵循此程序。可以执行其他方法，例如将特定染色质掺入 MDNA 中，以了解细胞规格发展后的分子机制。

这项技术为中枢神经系统发育领域的研究人员提供了挖掘波，以探索模式化、轴突生长和回路形成的分子机制。