Name: 在子宫内电穿孔:鼠标控制时空基因Transefection (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习小鼠胚胎中枢神经系统基因转染技术，利用光纤可视化与精密电极实现时空特异性电穿孔。该方法可精准靶向大脑皮层及丘脑等深层结构，为神经发育研究提供高效可靠的实验手段。

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本工作由理化学研究所脑科学研究所（RIKEN Brain Science Institute, BSI）、人类前沿科学计划（Human Frontier Science Program, HFSP）（授予T.S.）以及理化学研究所青年研究学者计划（RIKEN Junior Research Associate Program, JRA）（授予M.K.）资助。理化学研究所脑科学研究所（BSI）、人类前沿科学计划（HFSP）（授予T.S.）以及理化学研究所青年研究学者计划（JRA）（授予M.K.）资助了本研究。

1. 注射用毛细管和DNA溶液的制备
<ol>
	<li>使用Maxi-prep或等效方法纯化质粒DNA，并配制成终浓度为2-3 μg/μl。取100 μg DNA，加入10 μl快速绿色染料（1%母液）和TE缓冲液（10 mM Tris碱，1 mM EDTA溶液，pH 8.0），调整总体积至100 μl，使注射混合液中DNA的终浓度为1 μg/μl。质粒DNA的浓度可根据质粒大小及其转染效率进行调整，需单独测试确定。</li>
	<li>将DNA溶液在室温下以14,000 RPM离心5分钟，收集上清液以去除任何残留物。</li>
	<li>使用微量移液器拉制仪拉制玻璃毛细管。用镊子夹断尖端，使其直径为20–30 μm。从尖端起测量800 μm至1 mm处，检查其外径小于60 μm（图1A）。</li>
	<li>将毛细管连接至显微操作器，并用矿物油填充。为将DNA溶液注入毛细管，将尖端浸入溶液中，吸取DNA溶液。</li>
</ol>

2. 安装铂电极
本实验采用棒状铂电极（Nepe gene，型号：CUY611P2-1）对大脑浅层区域（如大脑皮层）进行电穿孔（图1F）。

3. 微电极的制备
使用微电极将基因转染至脑深部区域（即丘脑和下丘脑）（图2B-E）。

<ol>
	<li>将钨丝（用于负极）和铂丝（用于正极）的一端缠绕在镀金针脚上，并用Parafilm固定。将导线插入棉签杆内，并用Parafilm包裹两端（图1B）。</li>
	<li>用砂纸均匀地打磨导线尖端，使其外径达到20–30 μm，并确保从尖端起60 μm至800 μm-1 mm范围内的直径符合要求（图1C和D）。</li>
	<li>在导线上涂一层薄薄的指甲油以进行绝缘。待指甲油干燥后，使用浸有丙酮的棉签将尖端约200 μm处的指甲油擦除。
	重要提示：为防止损伤小鼠子宫，尖端800 μm-1 mm范围内的直径不得超过70 μm（图1E）。</li>
</ol>

4. 手术准备
<ol>
	<li>麻醉一只怀孕小鼠（E9.5–E15.5）。我们以药用级戊巴比妥钠进行麻醉示范（表II；每克体重50 μg，腹腔注射，等待5分钟）。替代戊巴比妥钠的麻醉方法包括氯胺酮/赛拉嗪注射或气体麻醉剂（短时操作推荐使用气体麻醉）。注射时应注意避免刺伤任何器官，否则可能导致子宫损伤或动物死亡。正确完成腹腔注射后，存活率超过95%。手术也可在开放空气环境中进行。开始手术前，通过夹捏动物脚趾测试其无反应性，以确认麻醉效果。</li>
	<li>使用刀片和50%乙醇去除腹部毛发。用聚维酮碘和酒精（70%）交替擦拭皮肤进行消毒。</li>
	<li>用精细剪刀在腹部正中线做切口，小心将所有子宫角取出，并置于围绕伤口放置的、预先在37 °C磷酸盐缓冲液（PBS）中浸湿的棉纱布上。始终用PBS保持子宫湿润。</li>
	<li>用食指和中指夹持一根柔性光纤电缆，并将其置于子宫角下方。使用前用70%乙醇清洁光纤。观察时无需显微镜或放大镜。将子宫置于光纤光源与拇指之间，轻轻挤压，使胚胎更贴近子宫壁。</li>
</ol>

5. DNA 注射与电穿孔
<ol>
	<li>当胚胎位置固定后，将玻璃毛细管小心插入目标脑室，并注入约 1 μl 的 DNA 溶液（图 2A）。</li> 
	<li>若对大脑浅层进行电穿孔，且使用板状铂电极进行电穿孔时，将电极置于子宫外，根据制造商说明施加推荐的方波电流脉冲（表 I）。若对大脑深层区域进行电穿孔，则使用微电穿孔针型电极。将细钨丝负极插入已注射 DNA 的脑室，将铂正极置于子宫内，并使目标区域位于两电极之间，然后施加推荐的方波电流脉冲（表 I）（图 2B）。</li> 
</ol>

6. 电穿孔后处理
<ol>
	<li>将子宫角放回原位，并加入 500 μL 预热至 37 °C 的 PBS。</li>
	<li>用手术缝线缝合内层，使用 9 mm 自动夹闭器关闭外层。</li>
	<li>将动物置于加热垫上 2 小时，使其从麻醉中恢复。可给予卡洛芬或丁丙诺啡等镇痛药以缓解术后疼痛。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
图32展示了在不同时间点使用铂金丝电极对pCAG-EYFP质粒进行皮层电穿孔的若干示例。大脑在胚胎期13.5天（E13.5）、14.5天（E14.5）和15.5天（E15.5）进行电穿孔，并在出生后第6天（P6）取材。RORc抗体染色显示了第4层的位置，而GFP抗体染色揭示了EYFP转染细胞的位置，两幅图像进行了叠加（图 3A和B）。标记的皮层细胞所在的皮层层数在每次实验中明显不同（图32），这表明时间依赖性的电穿孔可实现皮层层特异性的基因功能获得（GOF）或基因功能缺失（LOF）。
胚胎的存活率和细胞转染效率因胚胎年龄及电穿孔位置而异。样本列于表1中，但应根据脑部的不同发育阶段和区域，针对每次电穿孔实验优化实验条件。
使用铂金丝电极对丘脑和下丘脑等深部组织进行电穿孔时，效率通常较低（表1）。该问题可通过使用可到达脑深部区域的微电极来解决。图3和图4展示了在发育中的间脑进行pCAG-EYFP质粒电穿孔的示例。将质粒DNA溶液注入3rd E11.5 时期的脑室，随后进行微电穿孔（图 3C4C）。电穿孔区域局限于丘脑，此处大部分轴突投射至大脑皮层（图 3B4B）。通过EYFP可观察到轴突投射至大脑皮层第4层，EYFP可填充整个神经元。图 3A4A
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig1.jpg" alt="微电极制备示意图；包含组装和尖端测量。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 示意图展示毛细管的正确形状。（A）使用微电极拉制仪将玻璃毛细管拉制成特定形状。用镊子夹断尖端，使其直径为20–30 μm。从尖端起测量800 μm至1 mm（红色括号），并确保外径小于60 μm（绿色括号）。（B）将钨丝或铂丝的一端缠绕在镀金针脚上，并用Parafilm固定。然后使用砂纸打磨其尖端，使其外径为20–30 μm，并从尖端起60 μm至1 mm处符合要求。（C）钨丝成型前的图像。（D）钨丝成型后的图像。（E）涂覆薄层指甲油后的钨丝图像。E中的标尺为10 μm（C–E中的最小刻度）。（F）铂电极（Nepa gene. CUY611P2-1）。F中的标尺为2 mm。
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig2.jpg" alt="电穿孔示意图；侧脑室与第三脑室注射；胚胎基因修饰技术" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 手术操作示意图。（A）向侧脑室或大型胚胎（左侧）以及向3rd 心室或小型胚胎（右侧）。(B) 使用铂金棒状电极（左侧）和针型电极（右侧）进行电穿孔的示意图。
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig3.jpg" alt="神经发育阶段，GFP/RORc表达，显微镜图像，胚胎日E13.5-E15.5。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 图3. 在E13.5（A）、E14.5（B）和E15.5（C）时，对小鼠端脑进行pCAG-EYFP电穿孔，并在P6时收获。脑组织进行冠状切片，分别用GFP抗体或RORc抗体染色，图像合并显示。（A）在E13.5时进行pCAG-EYFP质粒电穿孔，可转染大量第4层神经元，其位置与第4层标志物RORc重叠。（B）在E14.5时进行pCAG-EYFP质粒电穿孔，转染的细胞位于第4层神经元更表浅的位置。（C）在E15.5时进行电穿孔，标记出大量表浅层神经元，如第2/3层神经元。 
比例尺：200 μm。
<img src="/files/ftp_upload/3024/3024fig4.jpg" alt="皮层和丘脑中的GFP与RORc表达；脑发育示意图，荧光显微镜图像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 图4. 将EYFP转染至丘脑-皮层轴突（TCA）。（A）通过GFP抗体染色显示TCA在皮层第4层的终末。RORc抗体染色用于标示第4层的位置。两幅图像来自同一组织切片并进行合并。（B）丘脑内电穿孔的位置也通过GFP抗体染色和RORc染色显示，其中RORc的表达局限于丘脑11。（C）示意图展示丘脑电穿孔及TCA投射路径。比例尺：200 μm。

<ol><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes+genes+and+neurogenin+regulate+non-neural+versus+neural+fate+specification+in+the+dorsal+telencephalic+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline.</a> Development. 135, 2531-2541 (2008).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).</li>
<li>Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTakahashi%2C+Y+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).</li>
<li>Feil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).</li>
<li>Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally-controlled+site-specific+mutagenesis+in+the+basal+layer+of+the+epidermis%3A+comparison+of+the+recombinase+activity+of+the+tamoxifen-inducible+Cre-ERT+and+Cre-ERT2+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases.</a> Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).</li>
<li>Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterned+expression+of+orphan+nuclear+receptor+genes+ROR+alpha+and+ROR+beta+in+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain.</a> Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本实验方案中，我们仅描述了使用不同形状的电极将 pCAG-EYFP 转染至小胚胎脑部特定区域这一技术的优势。关于不同启动子转染效率的比较此前已有报道，结果显示具有细胞类型特异性1。然而，该技术也存在局限性，例如转染仅为瞬时表达，且效果因质粒而异；该方法不具有细胞特异性，且难以控制被转染细胞的数量。因此，将本方案与其他技术相结合，可进一步拓展多种操作方法的可能性。首先，在质粒DNA中引入细胞特异性启动子可实现特定细胞类型的转染，例如神经元、胶质细胞和星形胶质细胞。其次，由于转染为瞬时表达，因此不适合需要研究基因在后期生命阶段功能的研究人员。因此，结合转座酶技术使质粒DNA整合到基因组中，可实现稳定转染8。此外，采用tet-on或tet-off系统可实现对神经细胞中基因表达时间或细胞类型特异性表达的调控8。另一种选择是将本方案与他莫昔芬诱导型Cre-ER(T)重组酶9及报告小鼠10相结合。
这种对组织的广泛可及性将彻底改变神经科学领域所采用的实验设计。

<table><tbody><tr><td>裸露钨丝直径 125 &amp;mu;m</td><td>A-M Systems</td><td>797600</td><td></td></tr><tr><td>裸露铂丝直径 125 &amp;mu;m</td><td>A-M Systems</td><td>767000</td><td></td></tr><tr><td>电极棒</td><td>Nepa gene</td><td>CUY610P4-1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Stoelting Co.</td><td>50611</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>KD Scientific</td><td>KDS310</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5865</td><td></td></tr><tr><td>脉冲发生器</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>9 mm 自动夹</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9260</td><td></td></tr><tr><td>镀金针脚</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5482</td><td></td></tr><tr><td>RORc 抗体</td><td>Perseus Proteomics</td><td>H3925</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

为了理解在发育中脑部特定区域表达的基因（包括信号分子和轴突导向分子）的功能，需要进行局部基因转染或基因敲除。通过结合特定的CRE品系实现局部区域的基因靶向敲入或敲除是可行的，但这种方法费时、费力且成本高昂。因此，一种简便的转染方法——在体电穿孔技术，因其操作时间短，可在制备转基因动物之前方便地检测候选基因的潜在功能1,2。此外，在体电穿孔可用于尚无特异性CRE品系的脑区，并有助于减少胚胎致死性3,4。本文介绍了一种结合两种不同类型电极的在体电穿孔方法，可实现向发育中脑部靶区域进行简单且便捷的基因转移。首先，采用光纤光源对胚胎进行固定，使较小的胚胎（自E9.5起）能够清晰可见，便于将DNA溶液精准注射至脑室，并将针状电极插入目标脑区5,6。脑部的区域模式化（如皮层区域）发生在胚胎发育早期，因此从E9.5开始的早期电穿孔对于全面理解脑区模式化事件具有重要意义。其次，毛细管的精确形状可避免因插入而对子宫造成损伤。此外，针状电极由钨丝和铂丝制成，使用砂纸打磨至尖锐，并以指甲油进行绝缘处理7，本实验方案对此方法进行了详细描述。该独特技术可将质粒DNA转染至脑部特定局限区域，并实现对小型胚胎的电穿孔。这将为研究细胞分化、细胞迁移以及早期胚胎阶段轴突导向的众多科研人员打开新的研究窗口。此外，该技术还可使研究人员将质粒DNA转染至发育中脑部的深部区域（如丘脑和下丘脑），而这些区域目前尚缺乏足够的区域特异性CRE品系用于功能获得（GOF）或功能缺失（LOF）分析。

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑 的技术。该独特技术可实现质粒DNA的时间和空间特异性转染，有助于众多神经科学家研究大脑发育过程。

为了理解发育中脑部特定区域表达的基因功能，包括信号分子和轴突导向分子……

本实验的总体目标是在小鼠胚胎中枢神经系统的特定发育时期和脑区实现高效的基因转染。首先，需要制备精密的毛细管和针状电极，以避免对子宫造成损伤。实验的第二步是学习一种独特的胚胎固定方法，利用光纤电缆照亮以清晰观察微小胚胎，从而实现靶向DNA注射。该操作的第三步是使用棒状电极对子宫表面进行电穿孔，以将DNA转染至大脑的浅层区域；操作的最后一步是使用针状电极对大脑深部结构（如丘脑和下丘脑）进行电穿孔。最终可获得显示皮质层、特定区域转染或丘脑高效转染的结果。该技术相较于现有的常规中性植入等方法，主要优势在于能够更清晰地观察并更精确地控制子宫内胚胎的植入位点。我们使用一种类似光纤的电缆，能够对 E 9.5 胚胎及通过针状电极将质粒 DNA 导入大脑深部区域（如丘脑和下丘脑）进行可视化操作。该方法有助于回答关于发育中大脑的关键问题，例如神经元分化、脑区模式形成以及神经连接。通常，初次接触该方法的研究者会面临困难，原因在于针头塑形、电极制作以及精确定位均具有较高技术难度。子宫和胚胎。该方法的可视化演示对于掌握如何精确制备针电极以及如何放置胚胎以进行电穿孔至关重要，因为这两个步骤是实验成功的关键。制备毛细管时，应按照制造商的说明使用微量移液器拉制仪。在此操作中，我们使用内无纤维的1毫米玻璃毛细管。用解剖显微镜和镊子将拉制的针尖夹断，使针尖末端外径小于60微米，并确保从尖端起长度为800微米至1毫米，最终针尖开口直径为20至30微米。使用测微计测量每根针。接下来，通过缠绕法制备微电极。将钨丝的一端缠绕在镀金针上。使用钨丝作为负极，铂丝作为正极。用参数将导线固定在针脚上。然后将导线插入棉签的塑料杆中，并用菲姆（phim）均匀地包裹两端。用细砂纸将导线尖端磨至尖锐，使其尖端直径达到20至30微米，且在距尖端800微米至1毫米处的直径为60微米。再次使用千分尺检查最终尺寸。接下来，将磨细的金属丝浸入一滴指甲油中，使金属丝表面均匀覆盖一层薄薄的绝缘涂层。待指甲油干燥后，使用蘸有丙酮的棉签擦去尖端最后200微米处的指甲油。铂电极可直接购买成品，无需额外制备。在此实验步骤中，我们使用 CUY 六 10 P 四-一 nepo 基因电极，通过大提或等效方法纯化质粒 DNA，将 100 微克 DNA 转移至新离心管中，并加入 10 微升 1% 快绿染料。用 TE 缓冲液将体积调至 100 微升，使最终质粒 DNA 浓度为 1 微克/微升。通过移液轻轻混匀溶液，然后在室温下以 14,000 RPM 离心 5 分钟，以去除杂质和盐分。将SNAT转移至新离心管中。在整个操作过程中，DNA溶液可保存在离心管中并置于室温下。接下来，根据制造商说明书，将拉制好的针头连接至显微操作器，将针头尖端浸入DNA溶液中，以充满针头。小心地将显微操作仪移至一旁，并在手术前准备好手术器械。在胚胎发育第9.5至15.5天期间称量怀孕小鼠的体重，以确定其体质量。随后进行腹腔注射。按每克体重50微克的剂量注射药用级戊巴比妥钠，注射后观察五分钟。戊巴比妥钠的替代药物可包括氯胺酮、赛拉嗪、速眠新或气体麻醉剂。麻醉后，使用剃须刀片和50%乙醇去除腹部的毛发。用聚维酮碘和70%酒精交替擦拭皮肤进行消毒。用精细剪刀在腹部正中线做一切口。小心地将所有子宫角拉出，并置于围绕伤口放置的、经一倍磷酸盐缓冲液（PBS）润湿的棉纱布上。始终用PBS保持子宫湿润。使用柔性光纤电缆。将导线置于子宫角下方。将子宫置于光纤光源与拇指之间，轻轻挤压，使胚胎向子宫壁方向上移。当胚胎头部位于左侧且朝上时，小心将玻璃毛细管插入目标脑室，于胚胎发育第13.5天时注入约一微升DNA溶液，用于皮层第四层的电穿孔。将铂丝电极置于子宫外，使用 38 伏特电压、50 毫秒脉冲时长的方波电流脉冲刺激五次。若在胚胎第 10.5 天通过微电穿孔靶向丘脑或下丘脑，则将细钨丝负极插入已注射 DNA 的脑室，铂丝正极插入子宫。使靶区域位于两电极末端之间，并以 7 伏特电压、100 毫秒脉冲时长的方波电流脉冲刺激三次。电穿孔完成后，将子宫角恢复至原始位置，并加入 500 µL PBS。使用手术缝线缝合切口的内层，然后用 9 mm 自动夹闭器闭合外层。将小鼠置于加热垫上两小时，以促进其从手术和麻醉中恢复。此处显示的是在胚胎第13.5天、14.5天和15.5天对皮层区域进行的铂金电穿孔操作。脑组织于出生后采集。第六天。每次实验中发生电穿孔的皮层细胞层明显不同。这表明，时间依赖性的电穿孔使得皮层各层的特异性功能获得和功能缺失成为可能。如图所示，对丘脑和下丘脑等深层组织进行电穿孔。使用铂金丝电极通常效率较低，而采用微电极进行电转染则对这些深层组织具有更高的效率和更好的细胞存活率。我们将血浆DNA溶液注入小鼠胚胎的第三脑室。在胚胎发育第11.5天，我们对丘脑进行针式电穿孔，大部分丘脑外显子在出生后第六天投射至大脑皮层。在此，我们展示了P-C-A-G-E-Y-F-P微电穿孔技术在发育中头部的应用。通过RORC标记所有丘脑后有丝分裂神经元，显示了丘脑区域。白色箭头所示的轴突投射至大脑皮层第四层，可通过EYFP可视化，EYFP可填充整个神经元。RORC抗体也标记了大脑皮层第四层的位置。一旦开始进行MA，若操作得当，每升样品可在15分钟内完成该技术。在进行此操作时，必须注意小心处理待测样品，以防造成任何损伤。遵循本操作步骤后，还可采用其他方法，例如将特定染料掺入线粒体DNA，以研究细胞发育后细胞特化的分子机制。该技术为中枢神经系统发育领域的研究人员探索图式形成、轴突生长和环路构建中的分子机制提供了有力工具。

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本方案详细描述了如何通过特定方法转染C57BL/6中枢神经系统的不同区域 in utero...

大脑皮层、海马、丘脑、下丘脑、外侧隔核和纹状体特异性 子宫内 C57BL/6小鼠中的电穿孔技术

子宫内双次电穿孔技术可用于靶向空间和时间上分离的细胞群体。该技术可用于在正常条件下通过荧光蛋白观察这些细胞群体之间的相互作用，也可在功能实验干扰目的基因后进行观察。...

双子宫内电穿孔技术用于时空分离的细胞群体靶向

在本实验方案中，我们描述了如何在E7.5时期向小鼠羊膜腔注射慢病毒，从而实现整个神经板的均匀转导，同时对胚胎存活率或发育过程造成极小的不利影响。...

小鼠胚胎7.5天在体纳米注射靶向神经板（NEPTUNE）技术

本文介绍了一种时间特异性方法，可有效调控小鼠胎盘中关键的发育通路...

小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作

学习小鼠胚胎中枢神经系统基因转染技术，利用光纤可视化与精密电极实现时空特异性电穿孔。该方法可精准靶向大脑皮层及丘脑等深层结构，为神经发育研究提供高效可靠的实验手段。

小鼠在子宫内电穿孔：可控时空基因转染

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小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

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