Name: 在小鼠永久性大脑中动脉结扎术中的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习小鼠大脑中动脉永久性结扎术，用于研究局灶性脑缺血和脑卒中病理机制。该方法通过电凝阻断MCA血流，产生可重复的梗死体积，提高术后存活率，适用于神经科学和脑卒中治疗研究。

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该手术技术最初在佐治亚州医学院William D. Hill博士的实验室中掌握。作者还要感谢David A. Rempe博士和Landa Prifti提供解剖相机的使用。本研究由NIH NS041744、NS051279、F31 NS064700以及AHA 30815697D资助。

本方案已获得罗切斯特大学动物研究伦理使用委员会（UCAR）的批准。实验过程中应遵循无菌操作技术。必须佩戴无菌手套和口罩。
本方案中使用的所有仪器、材料、化学品和工具均在表1中列出。
1. 术前准备
<ol>
<li>术前2小时、术后立即以及术后24小时内每3-5小时，对小鼠皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。</li>
<li>使用高压灭菌器对所有手术器械、纱布块和棉签进行灭菌。手术过程中将手术工具置于70%乙醇中，使用前在无菌纱布上晾干。用70%乙醇喷洒工作区域。</li>
<li>使用麻醉蒸发器，以3%异氟烷-20%氧气混合气体对小鼠进行麻醉。通过流量计调节氧气流量。通过脚趾或尾部夹捏测试麻醉深度（应无反应）。以2%（v/v）异氟烷维持麻醉水平。</li>
<li>在小鼠眼睛上涂抹人工泪液，并在手术过程中注意避免损伤眼睛。将小鼠置于侧卧位，右侧朝下。</li>
<li>使用动物专用剪毛器剃除左侧眼与左耳根部之间的毛发区域。使用棉签交替涂抹聚维酮碘溶液和70%乙醇清洁该区域，并轻轻擦拭。必要时重复操作。</li>
<li>将小鼠置于连接直肠探头的加热垫上，以维持体温在37°C。使用矿物油润滑后插入直肠探头。</li>
<li>将小鼠右侧朝下置于显微镜下，并用胶带固定。在纱布块上剪出一个窗口，覆盖手术区域。</li>
</ol>
2. 手术操作与大脑中动脉结扎
<ol>
<li>使用精细的直剪刀在左眼与左耳根部之间做一垂直切口。使用弯止血钳保持手术区域开放。</li>
<li>使用弹簧剪在颞肌上做一水平切口，并用镊子缓慢牵拉，将颞肌轻微分离于颅骨之外。</li>
<li>在持握下颌骨的同时，使用18G针头在颧弓与鳞状骨交界处进行小范围的颞下颅骨开窗。</li>
<li>使用骨钳去除小块颅骨以暴露大脑中动脉（MCA）。此过程中应避免损伤颧弓及眼眶内容物。若组织过度干燥，可使用无菌PBS棉签涂抹湿润。</li>
<li>使用小型血管电凝器结扎大脑中动脉（MCA）远端部分。</li>
<li>将颞肌复位至原始位置，并使用5-0尼龙缝线缝合切口。</li>
<li>停止麻醉，移除直肠探头。皮下注射第二剂丁丙诺啡（0.05 mg/kg）。将小鼠放回饲养笼，笼内温度维持在37°C，并配有加热板。</li>
<li>术后24小时内密切监测小鼠是否出现不适症状（食欲或饮水减少、弓背姿势、呼吸加快、毛发竖立）。术后每3–5小时皮下注射一次丁丙诺啡，持续至24小时。在此期间为小鼠提供恢复凝胶食物。</li>
</ol>
3. TTC 染色与脑梗死体积的测定
<ol>
<li>术后24小时，将小鼠深度麻醉，使用微型蠕动泵以中等流速经心脏灌注4% TTC（w/v）磷酸盐缓冲液（PBS）15分钟，随后灌注4%多聚甲醛溶液10分钟。取出脑组织并置于4%多聚甲醛溶液中过夜固定。</li>
<li>将脑组织放入切片模具中，使用剃刀片将脑组织切成1 mm厚的切片。</li>
<li>将脑切片置于毫米刻度尺旁，使用连接在体视显微镜上的数码相机拍摄切片图像。</li>
<li>使用Image J软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）通过从对侧总脑区面积中减去同侧未梗死区域面积来计算脑梗死面积。通过叠加各切片的梗死面积计算脑梗死体积22。</li>
</ol>
4. Image J 软件使用说明
<ol>
<li> 在 Image J 软件中点击文件菜单，打开待分析的图像文件。</li>
<li> 点击程序中的“直线（straight line）”选项卡。在标尺的两个边缘之间绘制一条直线。点击“分析（analyze）”菜单并选择“设置标尺（set scale）”。将已知距离设为 1，长度单位设为 mm。</li>
<li> 点击“自由手绘圆（freehand circle）”选项卡。绘制一个圆形以勾勒对侧半脑的轮廓。点击“分析（analyze）”菜单并选择“测量（measure）”。计算窗口将弹出，显示所绘制圆形的面积。</li>
<li> 在同侧半脑周围绘制另一个圆形，排除梗死（白色）区域。按照步骤 4.3 所示方法测量该区域面积。新数值将被添加至计算窗口中。第一个与第二个数值之间的差值即为梗死面积，用公式中的 A 表示。</li>
<li> 通过重复步骤 4.2–4.4 计算每张切片中的梗死面积。将各切片中计算得到的梗死面积求和（∑An）。由于每张切片厚度为 1 mm，因此该总和代表梗死体积。 
∑An × 1 mm（每张切片厚度）= 梗死体积</li>
</ol>
5. 典型结果：
通过永久性结扎小鼠大脑中动脉（MCA）所获得的梗死灶主要位于皮质区域。然而，如果在大脑中动脉的豆纹动脉分支近端进行结扎，则可能产生皮质下病灶。MCA结扎后的脑卒中体积可能介于10 mm³至35 mm³之间19, 23。Moyanova等人19使用TTC染色法计算的脑卒中体积为10 mm³至22 mm³，而Filiano等人23通过MRI图像测定的脑卒中体积则为20 mm³至35 mm³。造成这些差异的可能原因包括结扎位置的精确性以及测量脑卒中体积所采用的不同方法。 
图1显示了野生型C57/BL6小鼠在永久性大脑中动脉结扎术后24小时经TTC染色的脑组织。梗死部位呈白色（图1A、B）。图1A和B从不同角度展示了梗死区域。图2显示了从前往后依次切割的1 mm厚TTC染色脑组织切片（图2A-G）。术后24小时计算梗死体积，梗死体积约为23 mm³。
<img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig1.jpg" alt="小鼠脑解剖图，显示与标尺的大小比较；生物学研究，解剖学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. 脑卒中病灶位置示意图。 A-B，大脑中动脉结扎后24小时的全脑TTC染色图像。白色区域代表梗死灶。
<img src="/files/ftp_upload/3039/3039fig2.jpg" alt="前脑至后脑的横切面；解剖结构对比图；神经解剖学分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 图2. 代表性结果。 (A&gt;G) MCAO术后24小时的1 mm脑切片TTC染色结果。切片按从前到后的顺序排列。白色区域代表梗死灶。

<ol><li>Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+middle+cerebral+artery+occlusion+on+central+nervous+system+apoptotic+events+in+normal+and+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Diabesity+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats.</a> Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).</li>
<li>Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+leukotrienes+in+a+model+of+focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat.</a> Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).</li>
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<li>Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+studies+of+extracellular+metabolites+in+the+striatum+after+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats.</a> Stroke. 26, 878-884 (1995).</li>
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<li>Arlicot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+remote+microglial+activation+in+rodent+models+of+focal+ischaemia+using+the+TSPO+radioligand+CLINDE%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).</li>
<li>Moyanova, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+for+type+4+metabotropic+glutamate+receptors+against+ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage.</a> J Cereb Blood Flow Metab. , (2010).</li>
<li>Ortolano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+of+new+targets+for+pharmacological+intervention+in+stroke%3A+real-time+tracking+of+T-cells+in+the+ischaemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain.</a> Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).</li>
<li>O'Neill, M. J., A, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal cerebral ischemia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 9.6.1-9.6.32 (2000).</li>
<li>Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+brain+edema+on+infarct+volume+in+a+focal+cerebral+ischemia+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats.</a> Stroke. 24, 117-121 (1993).</li>
<li>Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transglutaminase+2+protects+against+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke.</a> Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

永久性大脑中动脉结扎法相较于其他现有方法，可获得高度可重复的梗死体积，并提高术后存活率。该方法操作简便，手术时间短（&tilde;30分钟）使该方法更加实用。该方法在小鼠和大鼠中均被广泛应用。
该技术需要在体视显微镜下进行侵入性手术，因此操作者必须具备显微镜下手术的经验，并熟练掌握成功的开颅技术。在正式实验开始前，最好先在实验室中建立稳定一致的梗死模型。为了获得可重复的结果，每次手术都必须在相同的确切位置结扎大脑中动脉（MCA）。如果希望产生皮层下梗死，应将MCA在豆纹动脉分支近端处结扎。该动脉被完全结扎，闭塞为永久性，因此该模型不允许通过MCA实现再灌注。尽管本演示中未包含此步骤，但最好使用多普勒探头测量受累区域的血流，以确认动脉是否完全结扎。
操作者在暴露和凝固大脑中动脉（MCA）时应格外小心，避免损伤或穿破该动脉。开颅手术应极为谨慎地进行，以防止对颧骨造成任何损伤。由于手术区域非常接近梗死区域，因此在开颅或烧灼过程中应避免对皮质表面造成任何损伤。可使用FST 18015-00烧灼器设备或双极烧灼器替代本演示中使用的FST...

小鼠永久性大脑中动脉结扎的应用

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

局灶性脑缺血是临床上患者中最常见的卒中类型之一。由于其重要的临床意义，长期以来人们一直致力于开发合适的动物模型，以研究缺血性损伤发生过程中的一系列事件。这些技术包括采用多种不同动物模型建立的短暂性或永久性、局灶性或全脑性缺血模型，其中最常用的是啮齿类动物。
永久性大脑中动脉结扎法在文献中也被称为pMCAo，被广泛用作啮齿类动物的局灶性缺血模型1-6。该方法最初由Tamura等人于1981年在大鼠中描述7。在此方案中，通过开颅手术暴露大脑中动脉（MCA），并用电凝法阻断其近端区域。梗死区域主要涉及皮层，有时也包括纹状体，具体取决于阻断位置。该技术现已成熟，并在许多实验室中广泛应用8-13。早期对该技术的应用促成了“梗死核心”和“半暗带”的定义与描述14-16，目前常用于评估潜在的神经保护化合物10, 12, 13, 17。尽管最初的研究是在大鼠中进行的，但经过 slight modifications 后，永久性大脑中动脉结扎法也已成功应用于小鼠18-20。
该模型可产生可重复的梗死区域，并提高术后存活率。人类约80%的缺血性脑卒中发生在大脑中动脉（MCA）区域。 21 因此，这是卒中研究中一个非常相关的模型。目前，可用于卒中患者的有效治疗手段十分有限，因此迫切需要良好的模型来测试潜在的药理学化合物并评估生理学结果。该方法还可用于研究细胞内低氧应答机制。 体内. 
本文介绍了在C57/BL6小鼠中进行大脑中动脉结扎手术的方法。我们详细描述了术前准备、大脑中动脉结扎手术操作以及使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法对梗死体积进行定量分析。

大脑中动脉（MCA）结扎是一种用于在动物模型中研究局灶性脑缺血的技术。该方法通过开颅暴露大脑中动脉，并采用电凝法进行结扎。与其他现有方法相比，该技术可获得高度可重复的梗死体积，并提高术后存活率。

局灶性脑缺血是患者中最常见的中风类型之一。由于其临床重要性，长期以来人们一直致力于……

本实验的总体目标是研究动物模型中的局灶性脑缺血。首先在左眼与耳根之间的皮肤上做一个小切口，随后在颧弓与鳞状骨交界处进行开颅手术，以暴露大脑中动脉，然后使用小型血管电凝器结扎大脑中动脉。最后，缝合皮肤以闭合伤口。最终可获得结果显示小鼠脑左半球存在梗死区域。可通过 TTC 染色或 MRI 扫描对脑组织进行染色，以实现对脑卒中的可视化观察。卒中后脑组织也可用于蛋白质或 mRNA 表达水平的测定。大家好，我是 Garza Chola，罗切斯特大学 Gale Johnson 实验室的一名研究生。该方法有助于解答脑卒中领域的一些关键问题，例如阐明导致缺血性脑组织细胞死亡的机制。手术前，需通过高压灭菌器对所有手术器械、纱布海绵和棉签进行灭菌。手术过程中，将手术工具保存在70%乙醇中，并在使用前于无菌纱布上晾干。手术前两小时，用70%乙醇喷洒工作区域。给小鼠注射0.05毫克/千克的丁丙诺啡。该药物将在手术后立即再次给予，之后在术后24小时内每三至五小时给药一次。使用麻醉蒸发器，以3%异氟烷和20%氧气的混合气体对小鼠进行麻醉。通过流量计调节氧气流量。通过脚趾或尾部夹捏测试麻醉深度。使用 2% 异氟烷维持麻醉水平。为小鼠眼睛涂抹人工泪液，并注意避免损伤眼睛。在手术过程中。使用动物用剪刀将小鼠置于右侧卧位。剃除左侧从左眼至左耳根部之间的毛发。使用棉签交替蘸取聚维酮碘溶液和70%乙醇清洁该区域，并轻轻擦拭。需要重复操作。将小鼠置于连接直肠探针的加热垫上，使用矿物油插入直肠探针，以维持体温在37摄氏度。将小鼠置于显微镜下右侧卧位，并用胶带固定。用直头精细剪刀在纱布海绵上剪出一个窗口，并覆盖手术区域。在左眼与左耳根部之间做一垂直切口。若手术过程中组织过度干燥，可使用弯头止血钳保持手术区域开放。使用棉签涂抹无菌 PBS。用弹簧剪在颞肌上做一横向切口，并用镊子缓慢牵拉，使颞肌与颅骨轻微分离。用弯头镊子夹住下颌骨，用18号针头在颧弓与鳞状骨交界处进行小范围颞下颅骨开窗。通过骨窗进路，操作者需移除颅骨的小片骨质以暴露大脑中动脉（MCA）。在此过程中应避免损伤颧弓和眶内结构。使用小型血管电凝器结扎大脑中动脉的远端部分，将颞肌复位至其原始位置，并用5-0尼龙缝线缝合。关闭切口部位时，停止麻醉并移除直肠探针。皮下注射第二次剂量的丁丙诺啡。将小鼠放回保持在37摄氏度的笼子中。使用加热板。术后24小时内密切观察小鼠是否有任何不适表现，包括食欲或饮水量下降、蜷缩姿势、呼吸加快或毛发竖立。手术后立即为小鼠提供恢复凝胶。术后等待两到三个小时，然后每三到五小时对小鼠皮下注射一次丁丙诺啡，持续至术后24小时。术后24小时，将小鼠深度麻醉，并用4%TTC灌流小鼠。取出脑组织并将其放入4%多聚甲醛溶液中固定过夜。次日，将脑组织置于切片包埋块中，使用剃刀刀片将脑组织切成1毫米厚的切片。将切片置于毫米刻度尺旁，使用连接解剖显微镜的数码相机，在 Image J 软件中拍摄切片图像。单击文件菜单并打开所需的照片。点击程序中的直线选项卡。在标尺的两个边缘之间画一条直线。单击分析菜单，选择设定比例尺。将已知距离设为1，长度单位设为毫米。然后单击自由手绘圆工具。绘制圆形以勾勒对侧半球的轮廓。点击分析菜单并选择测量。计算窗口将弹出，显示所绘制圆形的面积。在同侧半球周围再画一个圆，排除白色描边区域。按照之前所示方法测量该区域面积。新数值将被添加到计算窗口中。第一个值与第二个值之间的差值代表梗死区域的面积。通过将上述步骤重复应用于厚度为一毫米的切片，计算每个切片中的卒中面积。将各切片中计算得到的卒中面积相加，从而计算出卒中体积。该图显示了野生型 C57BL/6 小鼠在永久性大脑中动脉结扎术后 24 小时的 TTC 染色脑组织。脑梗死区域呈白色，可在不同放大倍数和角度下观察到。图中所示为 TTC 染色后脑组织切片（厚度为 1 毫米），从梗死灶前部至后部依次排列。术后24小时计算体积。梗死区域的体积约为23立方毫米。如果操作得当，该技术可在30分钟内完成。感谢观看。

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在小鼠永久性大脑中动脉结扎术中的应用

大脑中动脉线栓法阻塞是研究小鼠缺血性脑卒中的常用模型。...

小鼠卒中模型——线栓法大脑中动脉阻塞

我们在视频中演示了一种使用血管内单丝线栓在成年小鼠中建立大脑中动脉闭塞的方法。同时展示了如何通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色来评估脑梗死范围。...

小鼠大脑中动脉闭塞模型

本文介绍了小鼠大脑中动脉腔内阻塞模型。通过神经功能评分和焦油紫染色来评估脑梗死范围，后者是TTC染色的一种替代方法，具有可同时平行检测多种目的标志物的显著优势。...

大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型：通过焦油紫染色评估脑梗死

我们介绍一种高度可重复的啮齿类动物主要脑血管永久性闭塞的方法。该技术可实现极小的周围组织损伤、最少的失血量、较高的长期存活率，以及与人类临床人群相符的稳定梗死体积。...

永久性脑血管阻塞 通过 双结扎与横断

多种小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型广泛应用于实验性脑科学研究。本文展示了经颅永久性远端MCAO模型，该模型可产生稳定的皮质梗死，其大小与大多数人类缺血性卒中所造成的损伤相当。...

小鼠卒中模型：远端大脑中动脉永久性凝闭

脑卒中后脑内髓系细胞的表征可通过体视学结合光学分数器方法，或通过脑白细胞悬液的流式细胞分析来实现。这两种技术均有助于对缺血性脑组织中主要髓系细胞亚群进行准确的表型区分。...

短暂性或永久性脑缺血模型中白细胞亚群的体视学与流式细胞术表征

为了理解脑卒中的病理生理学机制，使用可靠的模型至关重要。本文将介绍小鼠中最常用的脑卒中模型之一，即大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内丝线或缝线模型），并包含再灌注过程。...

小鼠大脑中动脉闭塞与再灌注诱导脑卒中的手术方法

远端大脑中动脉分支的手术阻塞（MCAo）是实验性卒中研究中常用的一种模型。本文描述了永久性MCAo的基本技术，并结合了侧颅窗的植入，从而为小鼠的长期活体显微成像提供了可能。...

侧向慢性颅窗制备可实现小鼠远端大脑中动脉闭塞后体内观察

本方案展示了一种具有中等大小梗死灶且存活率极佳的独特小鼠卒中模型。该模型可使临床前卒中研究者延长缺血时间、使用老龄小鼠，并评估长期功能学结果。...

一种改良的经颅大脑中动脉阻塞模型用于研究老年小鼠的中风结局

本文介绍了一种通过经颅电凝法在C57BL/6J小鼠中建立远端大脑中动脉阻塞（dMCAO）模型的实验方案，并对随后的神经行为学表现及组织病理学特征进行评估。...

采用远端中动脉阻塞技术诱导小鼠急性缺血性脑卒中

本研究的目的是建立一种可重复的方法，用于在大鼠中实施开颅术，随后进行永久性、选择性大脑中动脉阻塞，以应用于运动和空间记忆缺陷的实验研究。...

大鼠大脑中动脉选择性永久性阻塞：研究运动与空间记忆障碍的实验方法

学习小鼠大脑中动脉永久性结扎术，用于研究局灶性脑缺血和脑卒中病理机制。该方法通过电凝阻断MCA血流，产生可重复的梗死体积，提高术后存活率，适用于神经科学和脑卒中治疗研究。

小鼠永久性大脑中动脉结扎的应用

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