利用质谱光度法在单分子水平研究抗原-抗体相互作用

为了利用质量光度法检测抗原-抗体相互作用，首先将所需浓度的纯化抗原和抗体在规定时间内进行孵育，以促进抗原-抗体结合。根据抗原结合的化学计量关系，这些抗体的抗原结合位点可结合不同数量的抗原分子。

将含有游离抗体以及抗原-抗体复合物的溶液流经预组装的流动室。将流动室固定在质光仪的显微镜载物台上。随后，将激光束穿过流动室，以实现最佳成像。

根据每个抗体所连接的抗原数量不同，复合物的分子质量也会发生变化。这些质量差异导致复合物对光的散射程度不同。

分子质量较大的复合物含有两个抗原结合在一个抗体的两个抗原结合位点上，其散射的光比仅含单个抗原的复合物更强。此外，游离抗体的光散射程度最低。

探测器收集散射光并测量其频率和强度。光度计记录散射光的波动，以干涉图样形式呈现，表现为斑点。

微弱的斑点对应游离抗体。相反，非常深的斑点代表含有两个抗原的复合物，而较浅的斑点含有一个结合的抗原。

暗斑的存在符合抗原-抗体相互作用。

为了通过质量光度法评估抗体-抗原亲和力，需在仪器物镜上滴加一滴显微镜浸油，并将流动室放置在显微镜载物台上。在流动室通道的一端加入10 µL过滤后的PBS。缓冲液将通过毛细作用进入通道。

在数据采集软件的聚焦控制选项卡中，使用粗调载物台移动的上和下按钮进行初步调整，然后单击清晰度以查看清晰度信号读数。使用微调的上和下调节按钮使清晰度值最大化，然后单击设定聚焦并锁定聚焦以激活聚焦跟踪功能。干净载玻片的图像其“信号”值应等于或低于0.05%。

按照演示方法加载 20 微升第一抗体-抗原样品，并用一小片吸水纸从另一端吸去液体。加载后立即点击记录，采集相当于 100 秒数据的适当帧数。数据采集结束后，输入数据文件名，点击确定，然后点击样品以保存文件。

为分析质量光度法数据，请打开目标文件并点击分析。点击加载以载入校准函数，然后点击文件和另存为结果，以保存已分析的数据。

为了获得样品中各物种的相对浓度，打开“eventsFitted.csv”文件，将M列中的数据复制到相应的绘图与分析软件中，并使用绘图/统计/直方图功能绘制分子量分布图。双击直方图以打开“绘图属性”窗口，关闭自动分组功能，并选择2.5千道尔顿的组距大小。

要创建组中心和计数数据，请点击应用和运行。要使用高斯函数拟合直方图，请选中组中心和计数两列，然后点击分析/峰拟合和基线/多峰拟合菜单功能。在分布图上双击以标出峰的大致位置，然后点击打开NLFit。

选中“xc”中心的固定复选框，并将其值设置为游离抗体以及单抗原-抗体复合物和双抗原-抗体复合物的预期分子质量。选中宽度参数的共享选项，然后点击拟合。

高斯组分的拟合峰高值代表样品中各组分的相对浓度。然后，利用该方程根据峰高值计算每种组分的浓度分数。