检测细胞粘附分子之间反式相互作用的细胞聚集检测

0 views • 4:16 min • July 8th, 2025

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神经系统中,跨细胞相互作用——突触前和突触后神经元上特定突触细胞粘附分子、跨膜蛋白之间的相互作用——在突触处形成复合物,介导跨突触信号传导。

要通过细胞聚集测定检测人胚胎肾细胞上表达的突触细胞粘附分子之间的跨细胞相互作用,请从转染的细胞悬液开始。

一个转染的细胞群表达所需的突触前细胞粘附分子和绿色荧光蛋白;另一个表达特定的突触后细胞粘附分子和红色荧光蛋白。还获得了两个表达绿色和红色荧光蛋白的细胞群。

心细胞。将细胞重悬于补充有钙离子的合适培养基中。将两个群体的转染细胞在试管中均匀混合。对其他细胞群重复上述步骤。

孵育过程中,钙离子与细胞群中表达的突触前蛋白上的特定位点结合。这增加了突触前蛋白与其他细胞群的突触后配体的相互作用,促进结合,介导这些细胞之间的嗜异性细胞粘附,并导致细胞聚集。

在荧光显微镜下,使用合适的通道对细胞进行成像,可视化细胞的绿色和红色荧光。处理图像。

在仅表达荧光蛋白的细胞群中未观察到聚集。由于表达突触细胞粘附分子的绿色和红色荧光细胞之间的重叠,细胞聚集被可视化为黄色,表明分子之间存在跨细胞相互作用。

染HEK293T细胞后 48 小时,从 6 孔板中收获细胞进行聚集。首先,用PBS洗涤每个孔两次。接下来,要轻轻地分离细胞,向每个孔中加入 1 毫升 10 毫摩尔 EDTA。然后,将板在 37 摄氏度下孵育。

孵育五分钟后,轻轻敲击板以分离细胞,并将每个孔收获到单独的 15 毫升锥形管中。在室温下以 500 x g 离心试管 5 分钟。

当细胞沉淀时,通过用实验条件标记微量离心管的顶部来制备六个孵育管。应使用 GFP 和 mCherry 的每种排列。

从 15 毫升锥形管中取出上清液,并将细胞重悬于 500 微升培养基中。使用血细胞计数器,对每个锥形管中的细胞进行计数。然后,将每种条件下的 200,000 个细胞等分到适当的孵育管中,以进行总体积为 500 微升的一对一混合。将孵育管置于室温下的慢速管旋转器中。

为了评估聚集,在基线和 60 分钟后再次,将 40 微升从孵育管移液到带电的显微镜载玻片上。将细胞添加到微量离心管后,应尽快进行基线采集。

绿色和红色通道的荧光下对载玻片进行成像。对于每张幻灯片,在一个焦平面上捕获三个不同视野的图像。

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Last updated: 1 August 2026