原位蛋白质-蛋白质相互作用研究的邻近连接实验

开始邻近连接实验时，取解剖后的线虫，将其固定在载玻片上，使生殖系细胞暴露。这些细胞中含有高水平的核糖核蛋白复合物，其中包括与伴侣蛋白结合的RNA结合蛋白（RBPs）。

在载玻片上加入两种识别特定靶蛋白的一抗——RNA结合蛋白（RBP）及其相互作用蛋白。随后向载玻片添加两种分别针对对应一抗的特异性二抗。

每种二抗均与PLA探针（具有互补序列的DNA链）偶联。二抗与预先结合的一抗结合，从而使两个PLA探针相互靠近。

加入含有连接子寡核苷酸的连接缓冲液——该寡核苷酸可与 PLA 探针杂交——并利用连接酶封闭缺口，形成环状 DNA。随后将载玻片与扩增溶液共同孵育，扩增溶液中含有 DNA 聚合酶、dNTPs 以及连接红色荧光染料的检测探针。

以环状 DNA 作为模板，聚合酶启动滚环扩增，产生多个首尾相连的模板 DNA 拷贝。扩增后的 DNA 仍与 PLA 探针相连，从而实现蛋白质-蛋白质相互作用的定位。

携带短单链寡核苷酸的检测探针与扩增DNA的互补区域结合，形成双链结构，并向蛋白质复合物传递荧光信号。在荧光显微镜下观察载玻片。

观察细胞内是否有明显的红色斑点，以判断蛋白质-蛋白质相互作用是否成功。

使用抗体稀释液稀释一抗。每张载玻片上 14 × 14 毫米的区域加 40 微升稀释后的一抗溶液。将载玻片置于湿盒中，于 4 摄氏度孵育过夜。

早晨，在 Coplin 染色缸中用 50 毫升 1× 洗涤缓冲液 A 室温下清洗载玻片两次，每次 5 分钟。将 Coplin 染色缸置于设定为 60 RPM 的旋转摇床上。将载玻片放在纸巾上，使洗涤缓冲液从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。

配制40微升含有正负探针的溶液。将该溶液加入每个14乘14毫米的区域。将载玻片置于湿盒中，在37摄氏度下孵育1小时。在室温下，用50毫升1×洗涤缓冲液A于柯铂染色缸中洗涤载玻片两次，每次5分钟。

将Coplin染色缸置于转速为60 RPM的轨道摇床上。用超纯水将连接缓冲液按1:5比例稀释。用此缓冲液将连接酶按1:40比例稀释，以制备连接反应工作液。将玻片放在纸巾上，使洗涤缓冲液从边缘流下，并轻轻擦拭边缘。

向每个 14 × 14 毫米的区域加入 40 微升连接反应液。将载玻片置于湿盒中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。按照前述方法洗涤并干燥载玻片后，向每个 14 × 14 毫米的区域加入 40 微升新鲜配制的避光保存的扩增溶液。

将切片置于37摄氏度的湿暗孵育盒中孵育1小时40分钟。用50毫升1x洗涤缓冲液B洗涤切片两次，每次10分钟，再用50毫升0.01x洗涤缓冲液B洗涤切片一次，每次1分钟。

在绘制好载玻片上环氧树脂涂层的边界后，向每个样本加入10 µL封片剂，轻轻将盖玻片覆盖在上面，使封片剂自然铺展。用指甲油沿盖玻片边缘涂抹，以密封盖玻片和载玻片。避免移动盖玻片。在室温避光条件下静置，使指甲油至少固化20分钟。