膜上蛋白质消化法用于制备共免疫沉淀蛋白质以进行相互作用研究

进行膜上消化时，取共免疫沉淀的蛋白质复合物溶液，每个复合物包含与伴侣蛋白结合的重组GFP标签靶蛋白。

将蛋白质转移至含有预润湿的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜的离心管中，并进行孵育。PVDF膜的亲水表面有助于将蛋白质转移至膜上。

将含有蛋白质的膜转移至新的离心管中。加入含有还原剂的缓冲液，以还原半胱氨酸残基之间的二硫键，从而在不破坏复合物相互作用的前提下，使其中的各个蛋白质发生变性。

用烷基化试剂替换该溶液，使复合物中蛋白质的巯基发生烷基化，从而防止二硫键重新形成。洗涤膜以去除多余的试剂。

用含有胰蛋白酶（一种蛋白水解酶）的缓冲液处理膜。胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸残基的羧基端切割GFP标记的目标蛋白及其相互作用蛋白，将较小的肽段释放到上清液中。将上清液转移至新的离心管中。

用酸性溶液洗涤膜，使结合在膜上的肽段完全解离，确保充分提取。将含有肽段的组分收集至同一管中。干燥 通过 真空干燥。

用低浓度甲酸重悬残渣，溶解肽段，即可用于蛋白质-蛋白质相互作用的鉴定。

为制备膜，使用手术剪将PVDF膜切成3毫米×3毫米的片状，手术剪需在使用前立即清洁。将膜片置于铝箔上，每片加入2至5微升乙醇。在膜完全干燥之前，每片再加入2至5微升蛋白洗脱液，然后空气干燥，直至膜表面变为无光泽。

然后将膜转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度下保存。若立即使用，向每张膜中加入2至30微升乙醇，使其变为亲水性。用移液器吸除乙醇。但在膜干燥之前，立即向每管中完全加入200微升基于DTT的反应溶液，并在56摄氏度下孵育1小时。

孵育后，将反应溶液替换为300微升碘乙酰胺溶液，避光孵育45分钟。然后用蒸馏水涡旋洗涤膜两次（每次至少10秒），再用2%乙腈涡旋洗涤一次（至少10秒）。

使用二硫苏糖醇和乙腈可能存在极高危险性。进行膜上消化实验操作时，必须始终佩戴口罩、护目镜和手套。

根据文稿说明配制胰蛋白酶，并向每张膜中加入 100 µL 胰蛋白酶反应溶液。在 37 °C 下孵育过夜以进行消化。

第二天，将反应液转移至洁净的1.5毫升离心管中，并向膜中加入100 µL洗涤液。在60 °C下孵育膜2小时。

然后，收集洗涤液并与反应液混合。向膜中加入另外100 µL洗涤液，超声处理10分钟。接着，收集洗涤液，并与反应液混合。用一片实验室封口膜覆盖试管，并用针在膜上刺出若干小孔。

使用真空浓缩仪将溶液干燥，并将残余物溶解于10微升0.2%甲酸中。在12,000 × g离心3分钟，将上清液转移至样品管中。

使用与纳米液相色谱HPLC系统联用的质谱仪分析样品。