免疫沉淀实验研究转染细胞中酶受体相互作用

程序性死亡受体-1（PD-1）是一种细胞表面受体蛋白，包含两个胞质酪氨酸基序——抑制性基序（ITIM）和转换基序（ITSM）。配体结合可诱导ITIM和ITSM的磷酸化，并促使酪氨酸磷酸酶蛋白SHP2募集至PD-1的胞质结构域，从而启动下游信号级联反应。

研究SHP2与PD-1的相互作用 通过 共免疫沉淀实验，获取贴壁的上皮细胞培养物。这些细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的野生型PD-1，其免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）和免疫受体酪氨酸转换基序（ITSM）处于磷酸化状态。同时获取表达GFP标记的突变型PD-1的上皮细胞，其中ITIM或ITSM的突变抑制了其磷酸化。

加入含有去垢剂和正钒酸钠的裂解缓冲液。去垢剂可裂解细胞，促使GFP标记的PD-1蛋白释放。正钒酸钠可抑制释放的磷酸酶，从而防止ITIM和ITSM的去磷酸化。

离心裂解液。将含有蛋白质的上清液转移至新的离心管中。加入包被有抗GFP抗体的琼脂糖珠。GFP标记的PD-1蛋白会与抗GFP抗体结合。

孵育SHP2悬液。磁珠结合的PD-1-GFP可结合SHP2。 通过 磷酸化的ITIM和ITSM。

加入Laemmli缓冲液并煮沸，使缓冲液中的还原剂和去垢剂使PD-1-GFP-SHP2蛋白复合物变性。离心后收集含有变性蛋白复合物的上清液。进行SDS-PAGE和蛋白质印迹（western blot）。

野生型及ITIM突变型PD-1可与SHP2相互作用，而ITSM突变体则无法结合SHP2，表明PD1与SHP2的相互作用依赖于磷酸化的ITSM。

进行免疫沉淀时，所有步骤均需在冰上或4摄氏度条件下操作。通过将一片蛋白酶抑制剂溶解于10毫升缓冲液中，向裂解缓冲液中添加蛋白酶抑制剂。此外，向将用于PD1-GFP转染培养板的缓冲液中加入1毫摩尔的正钒酸钠。向细胞中加入500微升预冷的裂解缓冲液，注意仅向含有PD1-GFP转染细胞的培养板中加入含正钒酸钠的裂解缓冲液。

使用细胞刮刀立即从培养板上刮下并收集细胞。将裂解物转移至1.5毫升预冷离心管中，并以0.005倍转速旋转混匀。 g 并在4摄氏度下放置30分钟。为收集裂解液中的去核上清，以10,000 × g离心沉淀 g 4摄氏度下孵育10分钟。

将上清液转移至新离心管中，并弃去沉淀。将用于第二组六块板的上清液置于冰上保存，用于后续WCL分析。

开始制备抗GFP磁珠时，打开瓶盖前应轻轻摇动以防止磁珠沉降。每种条件取40微升抗GFP磁珠悬液。在500 × g下离心 g 4摄氏度下离心3分钟。移除上清液以洗涤磁珠，注意尽量减少移液管与磁珠的接触，避免磁珠损失。

将珠子重悬于每份样品 80 微升裂解缓冲液中。将洗涤后的珠子直接加入第一组四块培养板中表达 PD1-GFP 的细胞裂解液中。以 0.005 倍速度旋转混匀 g 在4摄氏度下孵育30分钟，以免疫沉淀GFP标签蛋白。每次使用1毫升不含正钒酸盐的冷裂解缓冲液，共洗涤磁珠三次。随后，在2,500 × g条件下离心 g 10 秒。

将第一组培养板中具有活性的SHP2裂解液均分为三等份，每份加入含有经洗涤的PD1-GFP珠子的三个试管中。将未转染细胞裂解液体积的1/3加入另一管野生型PD1-GFP珠子中。弃去剩余的2/3裂解液。

将珠子在 4 摄氏度下孵育 4 小时，同时以 0.005 倍速度轻轻旋转 g. 此后，用1毫升冷裂解缓冲液将磁珠洗涤两次，每次洗涤使用1毫升。向每个样品中加入80微升裂解缓冲液，确保每管总体积为100微升。使用剪去尖端的移液枪头，轻轻吹打混匀。然后，从每管中转移50微升至两个新的1.5毫升离心管中。

首先，在 2,000 × g 和 4 °C 条件下离心珠子 30 秒，去除上清液。加入 20 µL 的 2× Laemmli 缓冲液，在 95 °C 下煮沸 5 分钟。使用 BCA 试剂盒测定输入对照的蛋白浓度。

将30微升最稀释的样品转移至新离心管中。使用裂解缓冲液将其余的上样对照稀释至与最稀释样品相同的浓度。然后，将每种稀释后的上样对照各30微升转移至新的离心管中。向上清液中加入等体积的2x Laemmli缓冲液，并在95摄氏度下煮沸5分钟。

此后，在 4 摄氏度下以 2,000 × g 离心 30 秒，沉淀磁珠，然后按照文本方案中所述进行 Western blot 分析。