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生物学技术
0 次观看 • 6:15 分钟 • July 8th, 2025
在细胞中，蛋白质通过其结构中的特定序列与相互作用的蛋白质结合，从而调控细胞内蛋白质的功能。
为了检测细胞内蛋白质相互作用，取贴壁细胞培养物。吸除培养基。
加入生物素标记的细胞穿透肽（BCPP）溶液，并进行孵育。
每种BCPP均包含一段有助于特异性结合靶向胞内蛋白的肽序列。该肽在N端含有一段细胞穿透肽（CPP），在C端含有生物素，便于检测。
孵育过程中，带正电荷的 CPP 区域促进结合肽穿过细胞膜进入细胞，到达细胞质。该肽与其细胞内相互作用蛋白结合——形成 BCPP-靶蛋白复合物。
加入含有去垢剂分子的缓冲液，以破坏细胞膜并释放BCPP-靶蛋白复合物及其他细胞组分。
加入链霉亲和素琼脂糖凝胶溶液——一种可特异性结合BCPPs中生物素的糖蛋白。孵育，使链霉亲和素与生物素发生不可逆结合，从而纯化链霉亲和素-BCPP-靶蛋白复合物。
离心以沉淀磁珠。将磁珠重悬于缓冲液中，以切断蛋白质之间的非共价连接，并从生物素-亲和素磁珠上洗脱CPP-肽-蛋白质复合物。
通过蛋白质印迹法分析 CPP-多肽-蛋白质复合物。若 CPP-多肽-蛋白质复合物的条带分子量高于其各组分，则表明相互作用的蛋白质伙伴之间成功发生了结合。
向细胞培养物中加入BCPP储备液的体积，以达到已被证实有效的浓度。
因此，加入92.8微升浓度为2毫克/毫升的TAT-Connexin-43266-283- 每毫升培养基中的生物素。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟，以确保BCPP与其细胞内相互作用伙伴之间的相互作用发生。
进行蛋白质提取时，首先完全吸除培养基。然后，每150平方厘米培养面积用10毫升预冷的磷酸盐缓冲液小心洗涤细胞，注意避免细胞脱落。
为获得细胞裂解液，每个150平方厘米的培养瓶中加入3毫升裂解缓冲液，使用细胞刮刀彻底刮取培养表面。将培养瓶倾斜约45度，有助于将细胞裂解液收集至相应的离心管中。
按每种条件，将1毫升细胞裂解液分装至3个已标记的1.5毫升离心管中。进行沉淀时，在4摄氏度下以11,000 × g 离心1.5毫升离心管10分钟。
将上清液转移至新标记为 A 的离心管中。根据每种条件，将上清液的等分试样转移至标记为 B 的不同离心管中。然后，每 50 µL 裂解液加入 16.6 µL 的 4× Laemmli 缓冲液，并在 -20 °C 下冷冻。接下来，通过轻轻振荡充分混匀 NeutrAvidin 琼脂糖。
剪去移液器吸头的尖端以增大其直径，从而改善磁珠的移液操作。然后，在 A 管中每毫升细胞裂解液加入 50 µL NeutrAvidin 琼脂糖。将细胞裂解液在 4 °C 下孵育过夜，并进行极轻微的振荡，以使 NeutrAvidin 与结合其细胞内互作伙伴的 BCPPs 发生相互作用。
然后，在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 1 分钟，以收集 NeutrAvidin 与蛋白质的复合物。小心移除上清液，并转移至标记为 C 的洁净离心管中。保留这些上清液，以备 pull-down 实验未成功时使用。
为了洗涤NeutrAvidin与蛋白质的复合物，向A管的沉淀中加入新鲜的裂解缓冲液。通过倒置重悬沉淀，并重复离心。此洗涤步骤共重复五次。所有这些上清液均可弃去。
接下来，向每管1.5毫升离心管中加入40微升2× Laemmli缓冲液，每管沉淀物来自150平方厘米培养瓶中汇合的细胞。然后在100摄氏度下洗脱5分钟，以解离蛋白质之间的相互作用。
洗脱后，在8,200 × g条件下离心30秒 g 离心收集NeutrAvidin珠。使用毛细管吸头将含有解离蛋白的上清液转移至新标记为D的离心管中。
这些上清液现在可用于蛋白质印迹分析，具体操作如文本方案中所述；或者可在-20摄氏度下冷冻保存。