酵母双杂交实验检测酵母细胞中蛋白质的自身结合能力

对于酵母双杂交实验，取缺乏转录激活蛋白GAL4的基因工程改造且处于活跃生长状态的酵母细胞悬液。这些细胞无法合成亮氨酸和色氨酸。 

加入一对表达质粒：其中一个质粒编码亮氨酸以及GAL4的DNA结合域（DNA-BD），并与目标蛋白的某个结构域融合；另一个质粒编码色氨酸以及GAL4的激活域（AD），并与目标蛋白的另一结构域融合。

加入含有合适转化试剂的缓冲液。对细胞进行热激处理，使其形成瞬时孔隙，从而促进细胞对质粒的摄取。随后冷却以重新封闭孔隙。将细胞涂布于缺乏亮氨酸和色氨酸的选择性培养基上进行培养。

表达两种杂交蛋白的转化细胞能够合成亮氨酸和色氨酸，存活并形成菌落。

与DNA结合域（DNA-BD）融合的蛋白质区域会结合到编码β-半乳糖苷酶基因启动子区域上游的特定DNA序列。如果目标蛋白质区域发生相互作用，则激活域（AD）与DNA-BD相互靠近，导致功能性的GAL4蛋白重建，从而引发β-半乳糖苷酶基因的表达。

将菌落转移至滤纸上。通过冻融细胞使其裂解，释放β-半乳糖苷酶。将此滤纸置于另一张浸有β-半乳糖苷酶底物的滤纸上。

释放的β-半乳糖苷酶将底物水解为半乳糖和一种不稳定的产物，该产物发生二聚化并被氧化，在滤纸上形成蓝色沉淀，表明目标蛋白结构域之间发生了相互作用。

在此酵母双杂交实验中，使用处于对数中期的酵母细胞进行转化。通过离心收集细胞。将每份细胞沉淀重悬于五毫升无菌水中，并合并细胞悬液。离心细胞悬液。

弃去上清液后，将酵母沉淀重悬于 1 毫升新鲜配制的无菌 1X 醋酸锂和 TE 溶液中。制备好的感受态酵母细胞必须在 1 小时内使用。通过将诱饵质粒和目标质粒 DNA 与 100 微克鲱鱼精子载体 DNA 混合来制备质粒样品。

向每个1.5毫升离心管中加入100微升感受态酵母悬液和600微升1×醋酸锂与PEG溶液，涡旋混匀约30秒。在30摄氏度下振荡孵育30分钟。加入80微升二甲基亚砜，轻轻翻转混匀。

在42°C水浴中热激15分钟，每2至3分钟混匀一次。将细胞悬液置于冰上冷却2分钟，然后离心回收酵母细胞。将每个细胞沉淀重悬于100 µL 1X TE缓冲液中。将细胞涂布于相应的选择性SD最小培养基平板上，以维持对诱饵和目标质粒的选择压力。将平板倒置，于30°C培养4至5天。

当酵母菌落直径约为两毫米时，即可用于本实验。用移液器将2.5毫升新鲜配制的Z缓冲液与X-Gal溶液加入洁净的100毫米培养皿中，并将一张纤维素滤纸放入培养皿内。将一张新的滤纸覆盖在含有待测酵母菌落的平板表面，用镊子轻轻按压滤纸使其与平板充分接触，静置约五分钟，使菌落附着于滤纸上。

在使用适当的个人防护装备的同时，小心地提起滤纸，将其浸入液氮中30秒。让冷冻的滤纸在室温下解冻2分钟。将菌落面向上的滤纸放置于100毫米培养皿内预先浸湿的滤纸上方，在30摄氏度下孵育，直至出现蓝色菌落。