串联亲和纯化实验用于研究蛋白质-蛋白质相互作用

串联亲和纯化是一种从细胞中分离蛋白质复合物以研究蛋白质-蛋白质相互作用的连续纯化方法。

首先，取表达带有表位标签的目的蛋白的细胞培养物。这些蛋白在细胞内形成复合物。复合物中的一个蛋白带有Strep标签，而另一个蛋白则带有FLAG标签。这些标签是基于小分子合成肽序列的亲和标签。

移除培养基，加入去垢剂溶液以裂解细胞。离心去除细胞碎片。收集含有目标蛋白复合物及其他细胞蛋白的上清液。

加入Strep磁珠——涂有链霉亲和素的琼脂糖磁珠——并进行孵育。蛋白复合物的Strep标签与链霉亲和素结合。离心收集结合有蛋白复合物的磁珠。洗涤以去除任何污染的细胞蛋白。

加入含有脱硫生物素（一种生物素衍生物）的洗脱缓冲液，通过竞争性结合链霉亲和素而置换出蛋白质复合物。离心后收集含有洗脱蛋白质复合物的上清液。

加入FLAG磁珠——即包被有抗FLAG抗体的琼脂糖磁珠，并进行孵育。蛋白复合物上的FLAG标签将与抗体结合。离心以收集结合有蛋白复合物的磁珠。

加入含有游离FLAG肽的洗脱缓冲液。该肽可竞争性地与抗体结合，从而置换出已结合的蛋白质复合物。离心以洗脱纯化的蛋白质复合物。

检测洗脱液中两种蛋白的存在，以确认目标蛋白之间的相互作用。

细胞裂解液与STREP磁珠悬液混合物在4摄氏度下孵育2小时后，于4摄氏度以1,1500 × g 离心2分钟。将上清液保留为“STREP AP 穿流液”，并于4摄氏度保存。

加入500微升STREP AP Wash Buffer 1至珠子中。在4摄氏度下将珠子与缓冲液混合物于旋转摇床上孵育5分钟，随后在1,500 × g条件下离心 g 在4摄氏度下离心2分钟。弃去上清液，再用500微升STREP AP Wash Buffer 1洗涤一次。

第三次洗涤后，将珠子溶液转移至新的1.5毫升微量离心管中，以降低蛋白背景。用STREP AP洗涤缓冲液1进行第四次洗涤。离心后，弃去上清液，并加入500微升洗涤缓冲液2。

通过倒置试管使磁珠充分平衡，随后在1,500 × g条件下离心沉淀 g 在4摄氏度下孵育2分钟，弃去上清液。用50微升STREP洗脱缓冲液洗脱目标蛋白。在4摄氏度下以800转/分钟涡旋振荡15分钟。将磁珠在1500 × g离心沉淀 g 在4摄氏度下孵育1分钟，收集上清液。此组分对应于 STREP AP 洗脱 样品

将珠子组分保存在 4 摄氏度，用于第二次洗脱。取 STREP 亲和纯化洗脱液的 10% 用于银染和/或蛋白质印迹分析。

为了增加后续 FLAG 免疫沉淀的起始材料量，可将第一次和第二次 STREP 洗脱液合并，以更高效地回收 FLAG 洗脱产物。

首先使用宽口移液器吸头将适量的 FLAG 珠溶液转移至微量离心管中。在 1,500 × g 条件下离心沉淀 g 在4摄氏度下孵育2分钟。移除上清液，向珠子中加入500微升FLAG洗涤缓冲液。

1,500 × g 离心 g 在4摄氏度下孵育2分钟。弃去上清液，并用FLAG洗涤缓冲液再次洗涤。第三次洗涤后，移除上清液，将磁珠重悬于FLAG洗涤缓冲液中，最终体积为n乘以16微升，其中n为样本数量。

向剩余的STREP AP洗脱液中加入16 µL FLAG磁珠悬液，并在4°C下旋转孵育过夜。在FLAG磁珠悬液与STREP AP洗脱液于4°C孵育过夜后，进行FLAG免疫沉淀。

在 4 摄氏度下，以 1,500 × g 离心 FLAG 磁珠悬液 2 分钟。将上清液保留为 “FLAG IP 穿流液”，并于 4 摄氏度保存。

加入500微升FLAG洗涤缓冲液至珠子中，在4摄氏度下翻转孵育5分钟，然后在1,500 × g条件下离心 g 在4摄氏度下离心2分钟。弃去上清液，加入500微升FLAG洗涤缓冲液，再次洗涤。

第三次洗涤后，将蛋白珠溶液转移至新的1.5毫升微量离心管中以降低背景信号。用FLAG洗涤缓冲液再洗涤一次。去除最后一次离心后的上清液，向珠子中加入30微升含有200纳克/微升FLAG肽的FLAG洗涤缓冲液。在4摄氏度下以800转/分钟涡旋振荡两小时。

2小时后，在4摄氏度下以1,500 × g 离心2分钟，沉淀菌体。收集上清液，并在4摄氏度下保存，作为“FLAG IP 洗脱液”。