利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

通过将噬菌体文库加入包被有靶蛋白的多孔板孔中，开始进行噬菌体展示。该噬菌体文库包含经过基因工程改造的噬菌体，每种噬菌体在其表面展示一种与外壳蛋白融合的独立蛋白质变体。孵育，使噬菌体与靶蛋白发生相互作用。

具有高亲和力靶蛋白结合能力的噬菌体可与靶蛋白结合。用缓冲液洗涤，去除未结合的噬菌体。加入酸性溶液，破坏噬菌体与靶蛋白之间的相互作用，使噬菌体释放到溶液中。使用缓冲液中和溶液pH，以维持噬菌体的稳定性。

将噬菌体转移至新的离心管中。加入含有蛋白质的封闭溶液孵育，以防止非特异性相互作用。

将噬菌体转移至处于活跃分裂期的 E. coli 菌液中，感染细菌并启动噬菌体复制周期。加入辅助噬菌体，其可感染细菌并提供包装子代噬菌体所需的外壳蛋白。将菌液转入选择性培养基中，使被噬菌体感染的细菌得以生长。

子代噬菌体最终会释放到培养基中。离心，收集含有噬菌体的上清液。加入沉淀液，浓缩噬菌体颗粒。离心，将噬菌体沉淀重悬于缓冲液中，得到均匀的悬浮液。

进行后续的噬菌体筛选轮次；重复噬菌体与靶蛋白结合、增加缓冲液洗涤严格性的洗脱步骤，以及扩增和离心步骤，最终富集展示出对靶蛋白具有高亲和力的噬菌体库。

将噬菌体文库置于冰上解冻。随后，用 PBS 将其稀释至文库多样性数量的 100 倍体积。加入相当于稀释后文库体积 1/5 的聚乙二醇/氯化钠溶液，在冰上孵育 30 分钟。接着，在 4°C 条件下以 11,000 × g 离心 30 分钟。弃去上清液，再离心两分钟以彻底去除残留上清液，并浓缩噬菌体沉淀。

将噬菌体沉淀轻轻重悬于每种待分析靶蛋白对应的1毫升PBT缓冲液中，通常共四种。向对照板的每个包被孔中加入100微升噬菌体文库。室温下以300 RPM转速振荡孵育1小时。

将目标板中的 PB 缓冲液弃入水槽，并用纸巾将板干燥。将对照板中噬菌体文库的全部 100 微升转移至目标板的每个包被孔中。在室温下以 300 RPM 轨道振荡孵育 1 小时。

接下来，从平板上移除噬菌体文库，并用 PT 缓冲液洗涤包被的孔四次。将平板倒置并在纸巾上轻拍，以去除残留的缓冲液。向每个包被的孔中加入 100 微升 0.1 摩尔的盐酸，以洗脱噬菌体。将平板在室温下孵育 5 分钟，同时以 300 RPM 进行轨道振荡。

随后，向每个包被孔中加入 12.5 微升 pH 11 的 1 摩尔 Tris 盐酸盐，以中和 pH 值。将全部八个孔中洗脱的噬菌体转移至一个 1.5 毫升微量离心管中。转移过程中用移液器吹打数次以使溶液均匀，并吸净孔中所有液体。向洗脱的噬菌体中加入 10% BSA，使其终浓度为 1%。

将微量离心管置于4°C保存。此为第一轮筛选的输出产物。通过从琼脂平板上挑取单个E. coli菌落接种至5毫升2YT/四环素种子培养基中，制备用于下一轮筛选噬菌体输入的种子培养物。

在37摄氏度、200 RPM振荡条件下过夜孵育。用适量PBS稀释第二轮和第三轮试管中的目标蛋白。取第二轮和第三轮试管中各一半的内容物，每种目标蛋白包被96孔结合板中的四个孔，用于下一轮实验。

接下来，取第一轮反应产物的一半用于接种3毫升对数中期细胞。在37摄氏度下以200转/分钟的转速振荡培养30分钟。加入M13KO7辅助噬菌体，使其终浓度达到每毫升10亿pfu。再次于37摄氏度下以200转/分钟的转速振荡培养1小时。

一小时后，将全部三毫升培养物转移至30毫升的2YT/羧苄青霉素/卡那霉素溶液中。在37摄氏度下以200转/分钟的转速振荡培养过夜。