0 次观看 • 7:05 分钟 • July 8th, 2025
为了确定目标蛋白在DNA上的结合位点，首先从含有目标蛋白的少突胶质前体细胞开始，该蛋白已与染色质中的特定DNA序列交联。
使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液处理细胞。裂解缓冲液可裂解细胞，而抑制剂则通过抑制蛋白酶活性来维持蛋白质-染色质复合物的完整性。
通过超声处理样品，将复合物剪切为较小的染色质片段，其中部分片段仍保留目标蛋白。
离心以沉淀细胞组分，并将含有染色质片段的上清液转移至新的离心管中。加入可特异性结合染色质片段上目标蛋白的抗目标蛋白抗体，进行孵育。
向试管中加入包被了蛋白A的磁珠，该磁珠可结合已结合抗体的Fc区。施加磁场，选择性沉淀与染色质片段形成复合物的抗体结合靶蛋白。
使用含有高盐的洗脱缓冲液处理珠子复合物，以破坏蛋白质-染色质相互作用，并释放不含相关蛋白的游离DNA。
使用有机溶剂提取DNA。加入扩增缓冲液，运行聚合酶链式反应以扩增DNA片段。扩增后，分析DNA序列。
将扩增产物的序列与细胞的基因组DNA序列进行比对。寻找片段与基因组DNA之间序列匹配的区域——该区域对应于蛋白质结合位点。
使用血细胞计数板计数后，将20,000个纯化的少突胶质前体细胞（OPC）加入1毫升OPC细胞培养基中用于染色质免疫沉淀（ChIP）反应。然后在室温下加入27微升36.5%的甲醛，孵育10分钟，以固定细胞。
10分钟后，在固定后的细胞中加入50微升2.5摩尔的甘氨酸，室温孵育5分钟。加入甘氨酸可终止DNA-蛋白质交联反应。随后，用含蛋白酶抑制剂混合物的1毫升HBSS缓冲液洗涤交联后的细胞。接下来，将细胞置于预冷的离心机中，以300 × g离心 g 4摄氏度
交联纯化的少突胶质前体细胞后，应使用预冷的HBSS溶液洗涤交联后的细胞，后续染色质免疫沉淀步骤均需在4°C下进行。否则，抗体将无法有效沉淀基因组DNA。
然后，向细胞沉淀中加入25 µL完全裂解缓冲液，冰上放置5分钟。接着，用移液器加入75 µL冰上预冷的含蛋白酶抑制剂混合物的HBSS缓冲液。随后，在预冷的超声破碎系统中对细胞裂解液进行染色质剪切，程序设置为5个循环，每个循环30秒开启、30秒关闭。
染色质剪切完成后，将细胞裂解液在14,000 × g条件下离心 g 4℃下离心10分钟。离心结束后，收集上清液。随后，取100微升剪切后的染色质，加入等体积含蛋白酶抑制剂的预冷ChIP缓冲液进行稀释。
接下来，向180微升稀释后的剪切染色质中加入1微升兔抗olig2抗体。将离心管置于4摄氏度、每分钟40转的旋转仪上孵育16小时。随后，在低温室中向ChIP反应管中加入10微升预先洗涤的蛋白A包被磁珠。再次将ChIP反应管置于4摄氏度的旋转仪上孵育2小时。
2小时后，将ChIP反应管置于磁力架上1分钟。随后，在4℃条件下，用100微升的四种洗涤缓冲液分别在旋转仪上洗涤磁珠沉淀，每种缓冲液洗涤4分钟。然后，向磁珠沉淀中加入200微升洗脱缓冲液。将反应管在65℃孵育4小时。
双链DNA变性后，通过添加虾碱性磷酸酶去除单链DNA的3'端磷酸基团。然后，使用末端脱氧核苷酸转移酶在单链DNA上添加poly(T)尾。接着，将DNA poly-(dA)引物退火至单链DNA模板。随后，利用正向和反向引物对ChIP序列文库进行扩增以实现加标签（indexing）。
文库构建所需的PCR循环次数取决于起始DNA的量。良好的文库构建需要对输入DNA的量进行准确定量。PCR循环次数过多或过少都可能影响文库浓度及其复杂性，从而导致PCR产物出现人为假象。
使用磁珠富集PCR扩增后的ChIP序列文库中长度为250至500个碱基对的片段。利用微流控ChIP毛细管电泳装置检测所选ChIP序列文库的质量。