利用荧光各向异性测定转录因子-DNA结合亲和力

转录因子（TF）是一种能够结合基因特异性DNA区域并调控转录的蛋白质。

为了通过荧光各向异性测量转录因子- DNA 相互作用，取一个多孔板。将熔化的凝胶与缓冲溶液混合后加入孔中，该缓冲溶液含有已知浓度的带有荧光标记的参照 DNA（包含转录因子结合位点）以及更高浓度的转录因子分子，然后孵育。

随着标记的参照DNA在凝胶中扩散，较高的转录因子（TF）分子浓度可确保所有DNA分子均与TF结合。加入含有单点突变的非标记竞争性DNA的缓冲溶液。

使用高性能荧光各向异性显微镜分析平板中的凝胶。

偏振光激发与参考DNA结合的荧光染料，该染料由于分子翻滚而发生取向改变，并发射出多方向的去偏振光——这一现象称为荧光各向异性（fluorescence anisotropy, FA）。

当结合到转录因子（TF）上时，参照DNA结合的荧光团分子量增加，翻转速度减慢，从而发射出更高偏振的光，使荧光偏振（FA）增强。

未标记的竞争性DNA随着时间在凝胶基质中扩散，形成由高到低的浓度梯度。较高的未标记竞争性DNA浓度会置换标记的参照DNA，使其自身与转录因子（TF）结合。释放的标记参照寡核苷酸翻滚速度加快，导致荧光各向异性（FA）降低。

绘制荧光团的荧光各向异性（FA）以及竞争性 DNA 浓度随时间的变化梯度——随着越来越多的竞争性 DNA 分子取代参考 DNA，其浓度逐渐降低。

为准备96孔板的滴定和校准孔，将两份凝胶储备液 aliquot 转移至75摄氏度的恒温摇床中。

每个滴定孔中加入1.4 纳摩尔参照DNA、终浓度为20至60 纳摩尔的转录因子蛋白、0.2 毫摩尔DTT，并用结合缓冲液将熔化的凝胶补至240 微升。

通过倒置并轻轻振荡试管，充分混匀。然后，缓慢地将含有DNA的凝胶每孔200微升加入至96孔板中指定的滴定孔内。对于每个校准孔，向240微升熔化的凝胶中加入5纳摩尔的尼罗蓝染料。避免产生气泡，缓慢地将含染料的凝胶溶液每孔200微升加入至96孔板中的五到六个孔内。

将凝胶置于完全水平的表面上，在室温下孵育10分钟，随后在4摄氏度下孵育10分钟。使用多孔板读板仪检测平板中不同孔内凝胶高度水平的均一性。

制备竞争DNA溶液时，首先将标记的参照DNA、蛋白质和三倍浓度的结合缓冲液混合。然后，取20微升该溶液与40微升每种已退火的竞争DNA溶液混合。

对于每个校准孔，将适当体积的其中一种退火的竞争性DNA溶液与含有15毫摩尔尼罗蓝染料溶液的三倍浓度结合缓冲液混合。最后，尽可能同时将50微升混合的竞争性溶液加至凝胶表面。

开始图像采集时，将96孔板放置在显微镜载物台上。随后对各孔进行时间序列的z-stack图像采集，直至蛋白质完全从参考DNA上解离为止。

根据手稿进行滴定实验。然后，使用 HiP-FA 软件为各个竞争序列生成滴定曲线。接着，点击 “导出” 按钮以获取每个滴定孔中解离常数及活性蛋白的浓度。