0 次观看 • 4:25 分钟 • July 8th, 2025
RNA结合蛋白（RBPs）通过与mRNA的翻译起始区（TIR）结合并抑制翻译，发挥转录后调控作用。
研究 RNA-蛋白质相互作用 通过 报告基因的翻译抑制，取含有两种质粒（结合位点质粒和RBP质粒）的细菌细胞培养物。
结合位点质粒编码一个荧光报告基因。转录后，产生的 mRNA 的 TIR 区域包含一个核糖体结合位点和一个发夹结构，其中含有可被 RNA 结合蛋白（RBP）识别的序列。
核糖体结合到mRNA上的结合位点，使发夹结构失稳，从而启动mRNA翻译并形成荧光报告蛋白。RBP质粒表达一种与不同荧光蛋白融合的嵌合RBP。嵌合蛋白的表达由一个可诱导启动子控制。
加入诱导剂，该诱导剂可激活转录因子，使其结合启动子，从而诱导嵌合蛋白的表达。嵌合蛋白的RNA结合蛋白（RBP）会结合发夹结构，阻止核糖体与mRNA结合，抑制报告蛋白的翻译。
随着诱导剂浓度的增加，RBP 的产量上升，导致核糖体与 mRNA 结合的竞争性抑制作用增强。
测量嵌合蛋白和报告蛋白产生的不同荧光信号。绘制信号曲线，获得剂量-反应曲线。
通过诱导剂介导的RBP表达增加，翻译抑制作用降低了报告蛋白的浓度，从而证实了RNA与RBP之间的相互作用。
将制备好的质粒转化至已含有RBP-mCerulean质粒的化学感受态细菌细胞中。为节省时间，使用八通道移液器将细胞接种到含有LB琼脂及相应抗生素的八区平板上。在37摄氏度培养16小时后应可见菌落生长。
为每个双转化子挑选单个菌落，并转移至含有1.5毫升添加适当抗生素的LB培养基的48孔板中。在37°C、250 RPM振荡条件下培养18小时。将过夜培养物的甘油菌保存于96孔板中，置于-80°C保存。
早晨，编程机器人将180微升半贫培养基（SPM）加入96孔板中并进行预热。编程机器人准备诱导剂板。
在洁净的96孔板中，使用由95% BA和5% LB组成的SPM配制孔内溶液。孔的数量应与所需的诱导剂浓度数量相对应。向诱导剂板中将含有最高诱导剂浓度的孔内加入C4-HSL。
接下来，编程机器人将每个最高浓度孔中的培养基依次稀释至23个较低浓度，浓度范围为0到218纳摩尔。每种诱导剂稀释液的体积应足以满足所有菌株的需求。
为了稀释过夜培养的菌株，将机器人程序设置为10倍稀释，即在48孔板中将20 µL细菌与180 µL SPM混合。然后，从稀释后的溶液中取20 µL加入预先准备好的适合荧光检测的菌株板中，再次进行10倍稀释。
现在，编程机器人根据最终浓度，将诱导剂板中的稀释诱导剂加入含有稀释菌株的96孔板中。将96孔板在37摄氏度下振荡培养6小时。在此期间，检测600纳米处的光密度（OD600），以及mCherry和mCerulean的荧光信号。 通过 每30分钟使用酶标仪检测一次。