改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

为了利用改良的酵母单杂交实验检测由多种蛋白质组成的异源蛋白复合物与靶DNA之间的相互作用，需取一个含有适当浓度、处于活跃生长期的转化酵母细胞培养物的多孔板。

这些细胞在报告基因——编码β-半乳糖苷酶的基因上游含有一段特定的DNA序列，该序列由GAL-4启动子驱动，但细胞本身缺乏内源性的GAL-4转录因子蛋白。细胞表达一种与GAL-4激活域融合的目标蛋白，以及另一种缺乏GAL-4 DNA结合域的蛋白。

如果这些蛋白质发生相互作用，则可能形成复合物，从而使目标蛋白能够结合报告基因启动子区域中的上游DNA序列。GAL-4激活域可激活报告基因β-半乳糖苷酶的表达。

离心。用适当的缓冲液重悬细胞。通过反复冻融裂解细胞，释放β-半乳糖苷酶。加入β-巯基乙醇和含有β-半乳糖苷酶底物的缓冲液。

β-巯基乙醇可稳定β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶水解β-半乳糖苷酶底物，生成黄色显色产物。

加入碳酸钠溶液以使β-半乳糖苷酶变性并终止反应。离心。将含有黄色显色产物的上清液转移至多孔板中。使用酶标仪在适当波长下测定溶液的光密度，以计算β-半乳糖苷酶活性。

较高的β-半乳糖苷酶活性表明蛋白质与目标DNA序列之间存在正向相互作用，从而导致β-半乳糖苷酶的表达。

重悬菌液，从每个孔中转移125微升至分光光度计检测板中。在600纳米处测定光密度，确保其值介于0.3至0.6之间。将深孔块中剩余的菌液在3,000 × g 21摄氏度下孵育10分钟。倒置以去除上清液。

向每个孔中加入 200 微升 Z 缓冲液并涡旋混匀。在 3,000 × g、21 °C 条件下离心 5 分钟。通过倒置去除上清液。向每个孔中加入 20 微升 Z 缓冲液并涡旋混匀。用耐冻融循环的封口箔覆盖板孔。

在通风橱中，使用液氮和37摄氏度水浴进行四次冻融循环。向每个孔中加入200 µL新鲜配制的Z缓冲液/β-巯基乙醇/ONPG溶液。在30摄氏度下孵育17至24小时，或直至颜色显现。检查颜色是否已显现。

向每个孔中加入110微升1摩尔碳酸钠以终止反应。记录时间，涡旋混匀平板，然后在3,000 × g下离心 g 21摄氏度孵育10分钟。使用多通道移液器将每孔125微升上清液转移至分光光度计板中，在420纳米处测定吸光度。