0 次观看 • 4:10 分钟 • July 8th, 2025
具有RNA解旋酶活性的蛋白质可帮助解开并分离RNA双链中的单个RNA分子。
为了确定蛋白质的解旋酶活性，取含有生物素标记的带有5'突出端的RNA双链体、ATP以及RNA捕获链（即与双链体中生物素化链互补的未标记单链）混合物的离心管。
将具有解旋酶活性的蛋白质加入每个试管，并孵育不同时间。该蛋白质会结合到双链的5'突出端。
利用ATP分子，它可断裂双链之间的氢键，导致双链解旋并释放出生物素标记的单链RNA。RNA捕获物与生物素标记的链相互作用，阻止其与已分离的链重新退火。
使用终止缓冲液终止反应。
将样品加入非变性聚丙烯酰胺凝胶的不同加样孔中，进行电泳。低分子量的单链RNA比高分子量的双链移动得更快。这种迁移率差异产生两条不同的条带。
将凝胶中的RNA转印至尼龙膜上。转印完成后，将膜暴露于紫外光下，使RNA交联固定在膜上。
加入化学发光酶标记的链霉亲和素，该物质可与双链和单链上的生物素相互作用。使用化学发光底物产生化学发光产物。
成像后，低分子量条带的强度随时间增加，与目标蛋白的解旋酶活性相关。
对于MOV10解旋酶活性检测，按照文稿中的说明混合试剂，并加入水使最终反应体积为20微升。将反应体系在37摄氏度下孵育10分钟、30分钟和60分钟，然后加入5倍浓度的终止缓冲液以终止反应。接着，制备一块20%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，将每种样品20至25微升加入到每个加样孔中。在冰浴条件下以100伏电压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部四分之一处。
丙烯酰胺具有危害性和毒性，操作时必须使用适当的个人防护装备。
拆卸凝胶板，修剪凝胶以去除加样孔和未使用的泳道。将凝胶置于0.5X TBE缓冲液中。将滤纸和尼龙膜裁剪至与凝胶相同大小，预先浸湿滤纸和膜，组装转膜叠层。
将样品从凝胶转移至膜上，使用半干式电泳装置，以90毫安电流转移20分钟。随后，通过以120毫焦耳/平方厘米的强度照射膜45至60秒，对样品进行交联。
进行化学发光检测时，首先向膜中加入20毫升封闭缓冲液，在轻轻摇动的条件下孵育15至30分钟。小心移除封闭缓冲液，替换为偶联物封闭缓冲液，再次孵育膜15分钟。
将膜在摇床上洗涤四次，每次5分钟。然后向膜中加入30毫升底物平衡缓冲液，在20至25 RPM的摇床中振荡孵育5分钟。
用底物工作液覆盖膜的整个表面，孵育5分钟。孵育结束后，在化学发光成像系统中扫描膜1至3秒。