基于免疫荧光的DNA修复蛋白相互作用可视化

辐射诱导的DNA双链断裂（DSBs）会启动DNA修复蛋白在损伤位点的招募——从而激活DNA修复。

为了利用间接免疫荧光法在 DSB 位点检测 DNA 修复蛋白 γH2AX 和 53BP1，取含有上皮细胞的盖玻片。对部分细胞进行辐照。孵育，使未辐照的对照组和辐照组细胞在特定时间点生长。

使用缓冲液处理以提取细胞核。固定细胞核以保持其形态。用封闭液处理，以减少非特异性一抗结合。

加入靶向两种DNA修复蛋白的一抗。这些抗体将结合到相应的蛋白上。

分别用红色和绿色荧光标记的二抗进行孵育。这些二抗可特异性结合各自对应的初级抗体。在载玻片上加入含 DAPI 的封片剂，将盖玻片封于其上，用于成像。

DAPI — 一种DNA结合染料 — 可结合双链DNA富含AT的次要沟槽，对细胞核进行复染。使用荧光显微镜观察细胞核。

与未受辐照的细胞核相比，受辐照的细胞核表现出多个γH2AX焦点，且这些焦点随时间推移而减少，表明在培养时间较长的细胞中DNA修复逐步进行。

红色和绿色荧光信号重叠时呈现黄色，表明在照射后 γH2AX 与 53BP1 在 DNA 双链断裂位点共定位。

将40,000个HeLa细胞接种于12孔板的每个孔中，每孔含有一个18毫米圆形玻璃盖玻片，培养至细胞融合度达到80%。细胞经4 Gray γ射线照射后，用1毫升PBS洗涤两次。随后完全移除PBS，每孔加入200微升NEB。室温孵育2分钟后，移除NEB。

请注意，孵育时间可能因细胞系不同而有所变化，但通常不应超过两分钟。用1毫升PBS洗涤细胞。然后完全去除PBS，并向每个孔中加入200微升4%多聚甲醛（PFA）以固定细胞。

将细胞在 4 摄氏度孵育 10 分钟，然后去除 PFA，并向每个孔中加入 1 毫升 PBS。彻底去除 PBS 后，向每个孔中加入 200 微升封闭液，在室温下孵育细胞 2 小时，或在 4 摄氏度孵育 16 至 18 小时。

将一抗用稀释缓冲液稀释，并涡旋混匀至充分混合。在湿盒内贴附一片Parafilm，加入10微升一抗，形成单个液滴。将盖玻片的一边与孔边缘对齐，使其接触液滴，然后缓慢放下盖玻片至Parafilm上，使液体均匀铺展。室温孵育盖玻片2小时。

孵育结束后，用 PBS 洗涤盖玻片，每次 1 分钟，共洗涤 3 次。将二抗用稀释缓冲液稀释，并涡旋振荡至充分混匀。按照先前所述方法，向每张盖玻片加入 10 µL 二抗，并在室温下避光孵育 2 小时。

用 PBS 洗涤盖玻片三次，每次 1 分钟，再用蒸馏水洗涤一次，每次 1 分钟。然后将盖玻片用含 DAPI 的甘油封片剂封固于载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘，室温静置 20 分钟使其干燥。在 60X 物镜上滴加一滴镜油，通过目镜观察并使用 DAPI 荧光定位细胞核。

对于XYZ图像采集，打开采集软件并设置 扫描仪 类型 作为 Galvano 的 扫描仪 模式 作为 圆形 三重反应 和 "512 由 512" 图像 大小 在PMT面板中，设置 模式 到 VBM, 平均值 到 帧， 和 连续的 扫描 到 线。 接下来，设置染料和热检测器。将通道1设为DAPI和SD1，通道2设为Alexa Fluor 488和HSD3，通道3设为Alexa Fluor 647和HSD4。选择 开启 在 Z.

为调整实时图像，请按下 Live 窗口中的 Live 按钮并调节焦距。然后，使用“PMT工具”窗口设置激光强度、灵敏度、增益和偏移量。对于Z轴层扫，请选择 Start to End 和15层切片。选择保存图像的文件夹，然后按下 LSM Start 按钮开始采集。完成后，按下 Series Done 按钮以结束图像采集。