基于免疫荧光的 DNA 修复蛋白相互作用可视化

0 次观看5:42 分钟 • July 8th, 2025

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辐射诱导的 DNA 双链断裂 (DSB) 在受损位点启动 DNA 修复蛋白募集,从而激活 DNA 修复。

要使用间接免疫荧光检测DSB位点的DNA修复蛋白γH2AX和53BP1,请取含有上皮细胞的盖玻片。照射细胞的子集。孵育,让对照的未辐照和辐照细胞在特定时间内生长。

用缓冲液处理以提取细胞核。固定细胞核以保持其形态。用封闭溶液处理,以尽量减少非特异性一抗结合。

添加靶向两种 DNA 修复蛋白的一抗。抗体与相应的蛋白质结合。

与分别用红色和绿色荧光团标记的二抗一起孵育。二抗(对每种一抗具有特异性)与其靶标结合。在载玻片上加入含有DAPI的封固剂。将盖玻片安装在其上进行成像。

DAPI(一种 DNA 结合染料)与双链 DNA 富含 AT 的小沟结合,对细胞核进行复染。使用荧光显微镜观察细胞核。

与未辐照的细胞核相比,辐照的细胞核表现出多个 γH2AX 病灶,这些病灶会随着时间的推移而减少,表明生长时间较长的细胞的 DNA 修复是渐进的。

重叠的红色和绿色荧光信号呈黄色,表明辐照后γH2AX和53BP1共定位于DSB位点。

首先在 12 孔板的每个孔中培养 40,000 个 HeLa 细胞,并使用 18 毫米圆形玻璃盖玻片,达到 80% 的汇合度。将细胞暴露于4灰伽马射线照射后,用1毫升PBS洗涤两次。然后,完全去除PBS,并向每个孔中加入200微升NEB。将细胞在室温下孵育 2 分钟,然后除去 NEB。

请记住

,孵育时间可能因细胞系而异,但通常不应超过两分钟。用 1 毫升 PBS 洗涤细胞。然后,完全除去PBS,并向每个孔中加入200微升4%PFA进行细胞固定。

细胞在 4 摄氏度下孵育 10 分钟,然后,除去 PFA 并向每个孔中加入 1 毫升 PBS。完全除去PBS,然后,向每个孔中加入200微升封闭溶液,并将细胞在室温下孵育2小时,或在4摄氏度下孵育16至18小时。

稀释缓冲液中稀释一抗,并将其涡旋直至充分混合。在湿度盒中,粘附一块封口膜,并在一滴中加入 10 微升一抗。将盖玻片的一侧从孔中与液滴对齐,然后慢慢将其降低到封口膜上,使液体扩散。将盖玻片在室温下孵育2小时。

孵育后,在PBS中洗涤盖玻片3次,每次洗涤1分钟。在稀释缓冲液中稀释二抗并涡旋直至充分混合。如前所述,将 10 微升二抗涂在每个盖玻片上,并在室温下孵育 2 小时,避光。

PBS 清洗盖玻片 3 次,用水清洗一次,每次洗涤 1 分钟。然后,使用含有DAPI的甘油基封片介质将它们安装到载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片,让它们干燥 20 分钟。将一滴浸油滴在 60X 物镜上,然后使用 DAPI 通过目镜定位原子核。

对于XYZ图像采集,打开采集软件,将"扫描仪类型"设置为"Galvano",将"扫描仪模式"设置为"往返",将"512 x 512"图像尺寸设置为"512 x 512"。在"PMT"面板中,将"模式"设置为"VBM",将"平均"设置为"帧",将"顺序扫描"设置为"线"。接下来,设置染料和热探测器。将通道 1 设置为 DAPI 和 SD1,将通道 2 设置为 Alexa Fluor 488 和 HSD3,将通道 3 设置为 Alexa Fluor 647 和 HSD4。在"Z"中选择"ON"

要调整实时图像,请按实时窗口上的实时按钮并调整焦点。然后,使用"PMT 工具"窗口设置激光强度、灵敏度、增益和偏移。对于 Z 堆栈,选择 从开始结束 和 15 个切片。选择要保存图像的文件夹,然后按 LSM 开始按钮开始采集。完成后,按"系列完成"按钮完成图像采集。

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最后更新:1 八月 2026