RNA-蛋白质下拉实验通过亲和提取分离RNA结合蛋白

为了分离RNA结合蛋白（RBP，即转录后调控因子），请取含有腺苷酸-尿苷酸富集元件（ARE）的小RNA探针悬液——该序列可被目标RBP识别。这些RNA探针用脱硫生物素（desthiobiotin，一种生物素衍生物）进行标记。

加入包被有链霉亲和素（streptavidin）的磁珠——一种对生物素具有亲和力的蛋白质。在振荡条件下孵育，以防止磁珠沉降。脱硫生物素标记的RNA与链霉亲和素结合，从而将RNA固定在磁珠上。

在磁场作用下，磁珠会聚集在管壁的一侧。移除上清液。将磁珠重悬于缓冲液中，以提供利于RBP-RNA结合的最适pH条件。

将磁珠暴露于磁铁后，磁珠会聚集在管壁的一侧。弃去上清液。将磁珠重悬于含有目标RNA结合蛋白（RBPs）的溶液中，并在振荡条件下孵育。

目标 RBPs 具有识别 ARE 序列的 RNA 识别基序，并能与 RNA 结合，从而在磁珠上形成固定的 RNA-蛋白质复合物。

在磁场作用下，磁珠向磁铁方向移动，同时不干扰蛋白质-RNA相互作用。弃去上清液。将磁珠重悬于含有生物素的洗脱缓冲液中。

生物素通过竞争性结合链霉亲和素，将脱硫生物素从磁珠上置换下来，从而洗脱蛋白-RNA复合物。

检测洗脱液中是否存在目标RNA结合蛋白，以确认蛋白质-RNA相互作用。

每50皮摩尔RNA，预先用50微升链霉亲和素磁珠进行洗涤。将含有链霉亲和素磁珠的离心管涡旋振荡15秒。振荡后迅速使用剪去尖端的移液器吸头，将200微升转移至洁净的1.5毫升安全锁离心管中。接着，将离心管置于磁力架上，使磁珠吸附至管壁一侧，静置1分钟。吸除重悬液。

洗涤磁珠时，将离心管从磁力架上取下，加入400 µL 0.1 M 氢氧化钠、0.05 M 氯化钠溶液，轻轻吹打数次。然后将离心管放回磁力架，静置1分钟，随后收集上清液。

用200微升100毫摩尔氯化钠溶液洗涤磁珠，并移除上清液。加入200微升20毫摩尔Tris溶液。通过移液重悬磁珠，并将离心管置于磁力架上。一分钟后，移除上清液。随后，将离心管从磁力架上取下，加入200微升1× RNA捕获缓冲液，并通过短暂涡旋重悬链霉亲和素-磁珠。

用剪去尖端的移液枪头吸取50 µL链霉亲和素磁珠，加入每个标记了RNA的离心管中。将各管在室温下于滚转仪上孵育30分钟。将离心管置于磁力架上静置1分钟后，吸去上清液。向磁珠中加入50 µL 20 mmol/L Tris溶液并重悬。随后将离心管放入磁力架中，静置1分钟后吸去上清液。

向 beads 中加入 100 µL 1× 蛋白质-RNA 结合缓冲液并重悬。然后将离心管放回磁力架中。待离心管在磁力架中静置 1 分钟后，收集上清液。加入 100 µL B 号主混合液。通过轻柔地吹打混匀以重悬，避免产生气泡。将反应管置于 4 °C 摇床上孵育 60 分钟。

进行洗涤和洗脱步骤。将离心管放入磁力架中。收集穿流液并转移至新管中。向磁珠中加入100 µL 1×洗涤缓冲液，轻轻重悬。将管子放回磁力架中，静置1分钟，弃去上清液。重复该步骤两次。

向磁珠中加入 40 µL 洗脱缓冲液。通过移液器吹打混匀，并在管式振荡器上孵育。将离心管置于磁力架中，静置 1 分钟，收集洗脱液样品。置于冰上，用于后续分析。