0 次观看 • 3:43 分钟 • July 8th, 2025
为了研究蛋白质与脂质分子的相互作用，首先准备两根毛细管。在两根管中加入荧光染料标记的待测蛋白质，并向其中一根管中加入未标记的脂质分子。将这些毛细管放入阵列中，并置于微量热泳仪内。
用聚焦的红外光照射含有蛋白质的毛细管，使焦点区域产生温度升高，热量通过溶液扩散，从而在含有荧光标记蛋白质的狭窄区域内形成温度梯度。
荧光检测器收集来自毛细管同一位置的荧光信号——该位置即激光聚焦处。处理器将信号转换并生成相对荧光强度随时间变化的图谱。
在温度梯度中，标记的蛋白质会从较热区域向较冷区域迁移，表现出热泳现象——一种依赖于温度的迁移现象。
由于热泳现象，荧光强度随时间逐渐降低，并最终达到稳态，此时标记的蛋白质达到平衡状态。
照射含有蛋白质-脂质混合物的毛细管，形成温度梯度。
在热泳过程中，迁移的标记蛋白与脂质分子相互作用，形成分子量更高的脂质-蛋白复合物，从而导致其迁移速度减慢。
这种差异性迁移导致荧光发生偏移，证实了蛋白质与脂质之间成功发生了相互作用。
开始分析之前，打开 MST 设备背面的电源开关，并启动控制软件。确认计算机已连接至设备并处于“已连接”状态，将MST前时间设为 3 秒，MST时间设为 30 秒，荧光恢复时间设为 1 秒后。
针对每根毛细管，输入目标配体的名称、配体分析物的名称、目标物的浓度，以及使用自动填充滴定比例的最高滴定浓度。选择一系列MST功率，并输入每个功率的数值，以测试最稳健的结合拟合效果。
为制备标记的微量热泳（MST）样品，将Vam7-八组氨酸溶液稀释至200纳摩尔浓度，NTA-Atto 647染料稀释至100纳摩尔浓度，均使用PBS缓冲液。按1:1的体积比混合Vam7-八组氨酸溶液与NTA-Atto 647染料，避光室温孵育30分钟。孵育结束后，对染料与蛋白混合物进行离心处理，并将溶液于4摄氏度保存数小时内待用。随后准备样品，取染料标记的配体并与分析物接触。
进行样品的微量热泳实验时，打开设备并拉出毛细管架。将样品毛细管加载到支架中，最高浓度置于位置1，并在控制软件中选择红色通道。然后，将支架装入仪器中。接着，选择适当的MST功率范围，启动Cap Scan + MST测量，并评估位移响应。