在支撑脂双层上进行pH调控检测以分析蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用

磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）是一种少量存在于细胞膜上的磷酸化磷脂。具有特异性PIP2结合结构域的磷脂酶C（PLC）可与PIP2结合，产生对多种细胞过程至关重要的第二信使。

检测PLC与PIP2的相互作用 体外 从小型单层囊泡（SUV）酸性悬浮液开始，该悬浮液包含 PIP2 和磷脂混合物，其中一种磷脂偶联了 pH 敏感型荧光染料。

用移液器将溶液加入已组装好的微流控装置的入口，并连接出口管路。将装置转移并固定到荧光显微镜载物台上。通过重力作用，小单层脂质体（SUVs）穿过由亲水性玻璃盖玻片制成的微通道底部。

小单层囊泡（SUVs）吸附在玻璃表面，溶液的pH值降低了两者之间的静电排斥力。SUVs与表面相互作用，发生形变并融合，形成大的囊泡。

当达到临界表面覆盖率后，囊泡会自发破裂，形成支撑脂双层（SLB）。通过通道通入缓冲液，以去除未吸附的囊泡。

使用合适的荧光通道，对微通道进行成像，以观察和测量SLB中pH敏感性染料的荧光——在低pH下荧光强度较高。

将重组PLC溶液引入微通道中。该溶液的中性pH值低于PLC的等电点，使PLC带正电荷。

带有 PIP2 结合结构域的重组 PLC 与 PIP2 结合，将带负电荷的氢氧根离子招募至双分子层表面。这使得双分子层表面碱性增强，导致染料的质子化状态发生改变，从而引起荧光淬灭，表明 PLC 与 PIP2 之间存在相互作用。

将100微升含有磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的小型单层囊泡转移至0.65毫升的微量离心管中。加入6.4微升0.2当量的盐酸，将溶液的pH值调节至约3.2。

通过进样口，用移液器将10微升pH调整后的单层小囊泡溶液加入每个通道，并通过移液器施加压力，直至溶液到达出样口。将移液器吸头从移液器上取下，但使其仍连接在装置上。对每个通道重复此步骤后，在室温下孵育装置10分钟。

在装置组装完成后，应立即向微通道中注入囊泡。同时，裁剪好进样端和出样端的管路。使用镊子将出样端管路连接至装置，然后用胶带将装置固定在显微镜载物台上。

将进样管路的一端浸入含有25毫升流动缓冲液的锥形管中，并用胶带固定管路以确保其稳固。使用实验室升降架将锥形管置于高于装置的位置，以促使溶液流经微通道。 通过 重力流

对于每个进样管，使用注射器从管路的游离端吸取1毫升运行缓冲液。取下进样口处的移液器吸头，将进样管的游离端插入装置中。重复此步骤，将所有进样管连接至装置。让运行缓冲液流经通道有助于去除多余的未破裂囊泡，并使双层膜达到实验条件下的平衡状态。

接下来，打开显微镜控制软件。在左侧面板中，点击 “显微镜” 选项卡，并选择 “10x” 物镜。点击 “实时”，然后点击工具栏上的 “Alexa 568” 图像图标。使用细调和粗调聚焦旋钮，对焦到微通道上。扫描整个装置，检查支撑脂双层（SLBs）和通道的质量。

然后，单击工具栏上的 “FL 快门关闭” 图标。点击 “采集” 选项卡，在 “基本调整” 下选择曝光时间，将曝光时间设置为 200 毫秒。在左侧面板中，单击 “多维采集”。在 “滤光片” 菜单下，选择红色通道。然后，点击 “时间间隔” 菜单，将时间间隔设置为 5 分钟，持续时间为 30 分钟，并设置间隔菜单。

在 “测量” 选项卡下选择 “圆形” 工具，并在任意通道中绘制一个圆形。选中该圆形后右键单击，选择 “属性”。在 “轮廓” 选项卡下，勾选 “所有 T”，以查看荧光强度随时间的变化曲线。请确保该曲线达到平台期，表明已达到平衡状态，然后再进行下一步操作。

将缓冲液降至与装置相同的水平面以停止液体流动。依次拆下每个出口管路，使用移液器向每个出口通道中加入200微升的相应蛋白稀释液。切勿施加任何压力，让重力自然完成加样过程。将移液器吸头从移液器上取下后，保持其连接在微流控装置上。对每个通道重复此操作，并确保在此过程中不会向通道内引入气泡。

接下来，将进样管路降低至微流控装置下方的地面位置，以使蛋白质开始流经微通道。将管路的自由端用胶带固定至废液容器。使Pleckstrin同源结构域的不同稀释液持续流动30分钟。在软件左侧面板的"时间序列"选项卡下，点击"开始"以重新开始成像。