定量细胞内氢核磁共振波谱法监测蛋白质-配体相互作用

为了在天然细胞环境中监测靶蛋白与小分子测试配体之间的相互作用，首先准备一支底部含有凝胶塞并装有缓冲液的核磁共振（NMR）管。将表达靶蛋白并包埋在琼脂糖中的细胞注入NMR管内，形成线状结构。

将试管装入生物反应器的流路单元中，并供给培养基以维持细胞活性。将流路单元插入核磁共振（NMR）仪器内。

在强磁场作用下，蛋白质中氢原子的原子核会被磁化并平行于磁场方向排列，进入低能态。

施加射频脉冲，使原子核与磁场呈反平行排列，从而使其跃迁至高能态。

短暂脉冲后，原子核会回到原始位置，并释放出所吸收的能量。检测器捕获该能量，生成代表氢原子共振频率的核磁共振（NMR）谱图。每个谱峰对应于特定电子环境中不同的氢原子。

将配体分子加入流动单元中。这些分子可穿透细胞内部，与靶蛋白相互作用，并改变氢原子周围的电子环境，从而引起共振频率的变化。

比较核磁共振（NMR）谱图。配体结合后的谱图差异表明蛋白质与配体之间发生了成功的相互作用。

用巴氏吸管将 60 至 70 微升的 1.5% 琼脂糖凝胶加入流动单元核磁共振管底部，置于冰上以形成 5 毫米高的底部塞。将细胞沉淀在金属加热块中加热 15 至 20 秒，然后在 450 微升琼脂糖溶液中小心重悬细胞，避免产生气泡。

将细胞-琼脂糖悬浮液吸入一段长度为30厘米、内径为0.75毫米、连接至1毫升注射器的色谱用PEEK管中。让该管在室温下冷却2分钟。在室温下，预先向流动单元NMR管中加入100微升PBS。通过轻轻推动注射器，将包埋在琼脂糖中的细胞丝注入流动单元NMR管中。

从流动单元中取出空的核磁共振（NMR）管，并将流速提高至2毫升/分钟，持续数分钟，以清除进样管路中残留的气泡。将流速调至0.2毫升/分钟，缓慢而稳定地向上推入含有细胞的NMR管。以0.1毫升/分钟的流速供给生物反应器培养基。

将核磁共振波谱仪的温度设置为 310 开尔文，并将流动单元插入波谱仪中。待生物反应器插入核磁共振波谱仪后，等待数分钟以完成培养基的交换。调节质子通道的匹配与调谐，匀场磁体，并计算质子 90 度硬脉冲长度。

根据质子硬脉冲调整每个脉冲序列中的质子功率水平。记录第一张 zgesgp 质子核磁共振谱，以获取样品成分和磁场均匀性信息。将 zgesgp 和 p3919gp 或 sfhmqc 实验复制至所需次数，并将其添加到采集队列中。

使用无菌长针头注射器刺穿硅胶管，将外部分子的浓缩溶液注入培养基储液瓶中。核磁共振实验结束后，将含有细胞的管路更换为空管，并用水冲洗流动单元。