尺寸排阻色谱结合多角度光散射分析蛋白质寡聚体

蛋白质寡聚体是由多个蛋白质亚基结合形成的较大功能单位的复合物。

为了通过尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）测定溶液中蛋白质单体及其寡聚体的分子量，需首先使用尺寸排阻色谱（SEC）柱进行分离。

柱内含有类似多孔筛子的球形凝胶珠，可截留较小分子。使用与蛋白质天然状态相容的缓冲液平衡柱子。

将含有蛋白质单体和寡聚体的样品加样至层析柱顶部。

在洗脱过程中，寡聚体流经色谱柱的颗粒间隙，而单体则被截留在微球的孔隙内。这导致较大尺寸的蛋白质寡聚体比小尺寸的单体迁移得更快。

将快速洗脱的寡聚体和随后缓慢洗脱的单体引导至MALS检测器。

当它们通过检测器时，激光会照射到它们，从而在不同角度发生散射。多亚基寡聚体会比单体散射更多的光。

在多个角度下散射光的强度与蛋白质寡聚体和单体的分子量成正比。

按照文本方案中的描述，首先准备 SEC-MALS 系统。使用 HPLC 级试剂，配制一升磷酸盐缓冲盐水，并加入 50 至 100 毫升氯化钠。使用瓶顶式聚醚砜滤器或类似装置将缓冲液过滤至 0.1 微米。

将最初50至100毫升的缓冲液过滤至废液瓶中，以去除干滤器中的微粒。随后，将剩余缓冲液过滤至一个洁净无菌的瓶子中，该瓶子应事先用过滤的去离子水清洗，并妥善保存以防止灰尘进入。

以每分钟0.5毫升的流速过夜冲洗色谱柱，使色谱柱在缓冲液中达到平衡并去除颗粒物。使用FPLC的“连续流”模式，并确保在所有SEC-MALS运行完成之前流速不中断。在过夜冲洗期间，将dRI流动池置于清洗模式。

开始冲洗时，应逐步提高流速，以防止因色谱柱内压力突然变化而导致的“柱填料脱落”现象。在开始进样运行前，应关闭吹扫。

通过轻轻敲击色谱柱下游的管路以释放积聚的颗粒，检查系统清洁度。观察MALS仪器前面板显示屏上90度检测器的信号。确认峰-峰值噪声不超过50至100微伏。同时确认折光指数（RI）信号稳定在小于1 × 10^-7 折光指数单位。

进行一次“空白”进样，以确认进样器无颗粒污染。所谓“空白”，仅是将流动缓冲液置于新的无菌小瓶中制备而成。如果颗粒峰的体积不超过1毫升，且峰高不超过基线以上5毫伏，则系统已准备好进行样品分析。否则，需重复进行空白进样直至系统洁净，或执行维护程序以清洗进样器。

现在，用SEC缓冲液配制至少200微升浓度为1至2毫克/毫升的BSA溶液。使用注射器滤器将蛋白质溶液过滤至0.025微米。弃去滤液的前几滴，以去除干燥滤器中的颗粒。或者，将样品在10,000 × g 条件下离心15分钟，使不溶性聚集体及其他大颗粒沉淀。然后，将100微升BSA溶液注入进样环中。