JoVE 实验百科全书
生物学技术
0 次观看 • 7:16 分钟 • July 8th, 2025
差示扫描量热法通过测量生物大分子在有无配体存在条件下变性所需的热量，来研究生物大分子与配体之间的相互作用。
首先，取一个含有游离DNA适配体（具有特定结构的单链寡核苷酸）的参考样品，以及一个含有热不稳定配体结合态适配体的待测样品。配体可稳定适配体的二级结构。
通过加热溶液进行正向扫描。当达到熔解温度时，游离的适配体发生变性。
配体稳定的适配体在相对较高的温度下会从配体解离并发生变性，导致其熔解温度较游离适配体升高。在高温条件下，一部分配体形成不可逆的二级结构，其结合亲和力较低。
接下来，通过冷却溶液进行反向扫描，以恢复适配体结构。在较低温度下，样品中的初始配体和转化后的配体均会与适配体结合。
在第二次正向扫描过程中，与转化后配体以弱亲和力结合的适配体在比初始配体结合适配体更低的温度下解离并变性，导致熔解温度下降。
随着连续扫描，配体持续转化为次要形式，导致初始形式完全耗尽。获取热谱图。
每次扫描时，配体结合的适体熔解温度均向游离适体方向偏移，表明该二级结构形式的结合亲和力较弱。
在将缓冲液、生物分子和配体溶液装入差示扫描量热仪（DSC）之前，先使用台式脱气仪对这些溶液进行脱气处理。从DSC上拧下压力手柄，然后将硅胶管从工作缓冲液引出，并连接到参比毛细管的前法兰上。
通过将参比端毛细管的后部法兰连接到样品端毛细管的前部法兰，搭建参比端与样品端毛细管之间的连接桥。接着，将一段硅胶管连接至样品端毛细管的后部法兰，并将硅胶管引至带有真空管线的废液瓶。开启真空管线，用200毫升工作缓冲液冲洗DSC系统。
首先，将长约3至5厘米的硅胶管连接到参比毛细管法兰上。接着，将一支1毫升的移液枪头插入后端法兰的硅胶管中。用移液器吸取0.8毫升工作缓冲液，并将带有缓冲液的移液枪头插入前端参比法兰的硅胶管中。
轻轻按压移液器活塞，使工作缓冲液通过前端硅胶管进入参比毛细管，并向上流入后法兰上连接的移液器吸头。继续下压移液器活塞，直至工作缓冲液液面升至前端硅胶管稍上方位置。然后缓慢释放移液器活塞，使工作缓冲液液面下降至后端硅胶管稍上方位置。重复使工作缓冲液在参比毛细管中来回流动，以彻底排除管内气泡。
接下来，用食指堵住后端移液管尖的开口，轻轻向上拉动后端移液管尖和前端移液管，将它们连同附着的硅胶管一起从参考法兰上取下。按之前的方法，用工作缓冲液填充样品毛细管。
将黑色塑料盖帽安装在后部的参比和样品法兰上，前部法兰保持裸露。将压力手柄连接到差示扫描量热仪（DSC），然后打开 DSC 软件，在功率读数稳定后，点击界面顶部的红色 “Up” 箭头，对仪器加压。DSC 的功率显示在界面右上角的方框中，同时显示仪器的温度和压力读数。
通过执行一次正向和反向扫描，用工作缓冲液平衡DSC。在屏幕左侧的“实验方法”选项卡中，确保已选择“扫描”选项，以使DSC在温度扫描模式下运行。
在“实验方法”选项卡下方的“温度参数”插图中，点击加热按钮。将实验温度的下限和上限分别设置为1和100摄氏度，扫描速率为1摄氏度每分钟，平衡时间为60秒。在平衡时间输入框下方点击“添加序列”按钮。在弹出窗口的“要添加的步数”字段中输入2，并勾选“交替加热/冷却”复选框，然后点击“确定”。
新增的扫描显示在界面的下方区域。检查每项扫描的参数是否符合预期。点击界面顶部的绿色“Play”按钮以开始实验。导航至目标窗口，并在弹出窗口中输入文件名以保存实验。点击“Experiment Method”选项卡右侧的“Data”选项卡，查看实验进度。
通过在两个毛细管中重新装入工作缓冲液，运行参考实验以对样品数据进行基线校正。在适当的温度范围内，以每分钟1摄氏度的速率采集多个正向和反向扫描，上部平衡时间为120秒。
通过逐一选中界面下部先前的缓冲液平衡扫描记录，然后单击界面中右侧的红色“X”，将其删除。
通过点击 “添加系列” 按钮， 在 “要添加的步数” 字段中输入 20，并勾选 “交替加热/冷却” 复选框，来添加新的扫描。然后点击 “确定”，并像之前一样点击绿色的 “播放” 按钮运行实验。
在两根毛细管中使用含有目标浓度配体的工作缓冲液重复上述步骤，以获得配体的参比实验。分别收集两次独立实验，用于获取热不稳定性配体转化的速率常数。
对于游离生物分子数据集，确保参考毛细管中含有工作缓冲液，而样品毛细管中含有溶于工作缓冲液并达到所需浓度的游离生物分子。接下来，采用与参考扫描相同DSC装样程序和实验参数运行样品实验。
对于配体结合实验，确保参考毛细管中的工作缓冲液含有配体，而样品毛细管中的工作缓冲液含有生物分子及配体。每次加入不同配体之间，需像之前一样冲洗系统。
进行一次额外的实验，将生物分子与热不稳定配体结合，并将高温平衡时间延长至600秒，其余所有实验参数均与之前相同。随后按照文本方案中所述进行数据处理与分析。