竞争性结合实验用于鉴定干扰受体-配体相互作用的化合物

竞争性结合实验可鉴定出通过竞争性结合靶受体而阻断受体-配体相互作用的小分子，从而抑制天然配体的结合。

为了在存在受体特异性小分子拮抗剂的情况下鉴定受体与其天然配体的相互作用，首先准备表达目标受体的人源T淋巴细胞悬液。

将细胞悬液加入含梯度递增拮抗剂浓度的多孔板孔中。孵育。拮抗剂结合于正构结合位点——即受体的天然配体结合位点。

向孔中加入固定浓度的荧光标记天然配体。孵育。

在低浓度时，拮抗剂占据的正构结合位点较少，允许天然配体与受体结合。然而，在较高浓度下，拮抗剂占据了大部分正构结合位点，导致天然配体与受体的结合极少。

离心以沉淀细胞。弃去上清液。将细胞重悬于多聚甲醛中以固定细胞，保持细胞形态。

使用流式细胞仪，分析表达拮抗剂和荧光标记配体结合受体的单个T淋巴细胞的荧光信号。

随着受体特异性拮抗剂浓度的增加，平均荧光强度呈剂量依赖性下降，表明拮抗剂与正构受体结合位点发生竞争性结合，从而抑制了天然配体与受体的相互作用。

首先，根据预设的实验布局，将100微升化合物溶液加入透明的96孔圆底板中。

使用多通道移液器将50微升细胞悬液从试剂储液槽加入96孔板中。将板在室温下避光孵育15分钟。

孵育后，从同一试剂储液槽中向96孔板的各孔加入50微升荧光标记的CXCL12（浓度为每毫升100纳克）。室温避光孵育30分钟。

接下来，在室温下以400 × g离心96孔板5分钟。通过翻转孔板去除沉淀细胞中的上清液。将孔板在纸巾上干燥。使用多通道移液器从试剂储液槽中向各孔加入200 µL新鲜的检测缓冲液。

立即再次以400 × g离心平板5分钟，温度为室温。再次通过翻转平板去除上清液，然后在纸巾上干燥。最后，将细胞沉淀轻轻重悬于200 µL含1%多聚甲醛的PBS溶液中。此步骤可固定细胞。

使用流式细胞术分析样本时，启动仪器并打开相应的软件。选择以点图形式显示的细胞参数，包括前向散射面积、侧向散射面积，以及以直方图形式显示的荧光染料检测通道。

选择一个样本，例如阴性对照样本，根据前向散射和侧向散射参数对定义的均一细胞群体进行设门。调整细胞上机进入流式细胞仪的设置参数。

注射前选择三种混合液。选择自动注入100 µL固定细胞，并设置样品流速为1.5 µL/s。点击“采集数据”开始运行样品。此时，该样品的前向散射和侧向散射参数以及荧光染料检测结果将显示在屏幕上。

现在，选择软件的设门工具。根据前向散射和侧向散射的点图可视化结果，通过设门预定义一个均一且具有活性的细胞群体。选择每份样本分析 20,000 个“事件”。

这意味着，对于每个样本，将最终分析位于预设门控范围内的 20,000 个细胞。数据采集将持续进行，直至达到该事件数量为止。

通过首先选择要分析的孔来启动运行，然后选择“运行孔”。

流式细胞仪将逐个分析这些样品，记录每个样品的平均荧光强度，该强度对应于位于预设门控范围内的20,000个细胞所产生的平均荧光信号。

最后，按照方案中所述进行数据分析。