0 次观看 • 3:35 分钟 • July 8th, 2025
为了研究受体-配体相互作用，首先准备一个含有培养基的多孔板，其中培养基包含表达待测配体的靶细胞。
加入基因工程小鼠BW细胞——一种表达膜结合型嵌合受体的新型B细胞群体。嵌合受体由特定受体的胞外域与B细胞受体的跨膜域及胞内信号域融合而成。
靶细胞上的配体与BW细胞嵌合受体的胞外域相互作用，导致BW细胞内信号传导结构域的激活。这会启动下游信号通路并促进细胞因子的产生 — 在BW细胞外释放并出现在培养基中的分泌型报告分子。
离心反应板。将含有细胞因子的上清液转移至预先包被抗细胞因子抗体的ELISA板中。细胞因子与抗体的Fab区域相互作用，从而被固定在板的表面。
使用封闭液处理平板，以封闭非特异性结合位点。加入生物素标记的抗细胞因子抗体，该抗体与预先结合的细胞因子相互作用并形成免疫复合物。
加入酶偶联的链霉亲和素溶液覆盖微孔板。链霉亲和素可与免疫复合物上的生物素结合。
加入底物处理该孔板。酶与底物相互作用产生有色产物，使溶液呈现相同颜色。溶液显色表明报告分子的存在，提示受体-配体相互作用成功发生。
在96孔板的单个孔中使用50,000个转染的BW细胞及其相应靶标。将培养板孵育48小时，随后在-20摄氏度下冷冻保存。
用抗小鼠 IL-2 抗体包被 ELISA 板。在每孔中加入 50 微升 PBS 缓冲液，其中含有 0.05% 微克的抗小鼠 IL-2 抗体。将包被好的酶标板在 4 摄氏度下孵育过夜。
将先前与靶细胞共孵育的冷冻BW细胞在37摄氏度下短暂孵育以解冻。随后离心培养板，并将每孔中的100微升上清液转移至预先包被的ELISA板中，在37摄氏度下孵育2小时。
此后，向ELISA板中加入生物素标记的抗小鼠IL-2抗体。然后，经孵育和洗涤后，向ELISA板中加入HRP标记的链霉亲和素。再次经过孵育和洗涤后，向ELISA板的每个孔中加入100 µL TMB底物溶液。最后，在650 nm波长下读取ELISA板的吸光度。