Name: 优化的基于PCR的检测支原体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 学习使用优化的PCR方法检测细胞培养中的支原体污染。本视频演示LookOut支原体PCR检测试剂盒的操作步骤，包括样品制备、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果分析，帮助研究人员确保细胞培养完整性。

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由 Sigma-Aldrich 资助

1. 支原体检测
<ol>
	<li>细胞培养上清液可直接检测，或制备后于日后使用。若需日后使用，请取100 μl上清液加入无菌扩增管中，在95°C孵育5分钟。完成后，样本可在2–8°C保存最多一周。上机检测前，短暂离心（5秒）以沉淀任何细胞碎片。</li>
	<li>为准备PCR样本，需计算Jumpstart Taq DNA聚合酶/复性缓冲液所需的总体积。本实验共进行5个反应。5个反应共需2.5 μl Taq和114.5 μl复性缓冲液。其中每个反应至少含1单位Taq，每个样本反应和阴性对照需22.5 μl复性缓冲液，阳性对照额外需24.5 μl复性缓冲液。每反应应加入1单位DNA聚合酶至相应体积的复性缓冲液中。具体用量依所用Taq酶而定。</li>
	<li>将计算好的Taq DNA聚合酶体积加入洁净的微量离心管中，随后加入计算好的复性缓冲液体积。通过轻弹管壁轻轻混匀DNA聚合酶与复性缓冲液。此混合液不得涡旋震荡。</li>
	<li>使用试剂盒提供的透明反应管准备阴性对照和样本。试剂盒提供的反应管中已含有核苷酸、引物及内参DNA。将前一步骤配制的23 μl Jumpstart Taq DNA聚合酶/复性缓冲液混合液加入每个阴性对照管和样本管中。向阴性对照管中加入2 μl无DNA水，向每个样本管中加入2 μl待测样本，并做好标记。通过轻弹管壁混匀内容物。内容物不得涡旋震荡。</li>
	<li>使用试剂盒提供的粉色反应管准备阳性对照。试剂盒提供的反应管中已含有核苷酸、引物及内参DNA。将前一步骤配制的25 μl Jumpstart Taq DNA聚合酶/复性缓冲液混合液加入反应管中，并做好标记。通过轻弹管壁混匀内容物。内容物不得涡旋震荡。将阴性对照、阳性对照及样本管在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>为进行PCR，需将样本放入热循环仪中。使用JumpStart Taq时无需激活步骤。将反应管放入热循环仪中，循环程序设置如下：94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 40秒，共运行40个循环。</li>
	<li>PCR循环完成后，应将样本从热循环仪中取出并置于冰上，冷却至4–8°C。样本冷却后，应立即进行琼脂糖凝胶电泳。无需额外添加上样缓冲液和染料，因其已存在于反应管中。每个PCR产物直接上样8 μl至独立泳道。当条带迁移2.5–3.0 cm时，停止电泳。</li>
</ol>
2. 代表性结果
阴性对照应在约 481 bp 处显示一条条带。在视频开头展示的电泳凝胶的阴性对照泳道中可以观察到这一点。若在 481 bp 处未出现阴性对照条带，则表明所使用的 Taq 聚合酶活性不足或灵敏度不够。
支原体阳性样本将在270 ± 8 bp范围内出现条带。高度污染的样本条带较深，轻度污染的样本条带较浅。电泳凝胶中阳性样本列的条带强度差异可在视频开头展示的图像中观察到。所有样本均包含内参阴性对照，以证明PCR反应按预期进行。在高度污染的样本中，内参对照条带可能不出现，此现象属正常情况。
如果您的样本在阳性范围或阴性范围内均未出现条带，则表明样本可能存在抑制现象。若样本受到抑制，可通过进行DNA提取来去除PCR抑制物。
<img alt="DNA凝胶电泳结果；250 bp DNA标记、对照、不同污染程度的样品。" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 相关扩增子条带：显示通过PCR检测支原体的结果。第2道为阴性对照，应出现一条约481 bp的条带。若481 bp处的阴性对照条带缺失，表明所用Taq酶的灵敏度不足。支原体阳性样品将在270 ± 8 bp范围内出现条带，如第3–6道所示。高度污染的样品条带较深（第6道），轻度污染的样品条带较弱（第4道）。所有样品均包含一个内参阴性对照（481 bp），以证明PCR反应按预期进行。在高度污染的样品中，内参对照条带可能不显示，此现象属正常。

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

作者是 Sigma-Aldrich 的员工，该公司生产了本文所用的试剂和工具。

由于试剂盒具有极高的灵敏度，若操作正确，应能获得精确的结果，以明确样本是否存在支原体污染。该试剂盒已针对JumpStart Taq DNA聚合酶进行优化。在样本制备过程中也可使用其他Taq酶，但应出现481 bp的内参条带，以表明所用Taq酶具备适当的灵敏度。阳性条带的密度可能因污染程度不同而有所差异。在严重污染的样本中，可能观察不到内参条带。使用LookOut支原体PCR检测试剂盒时，样本制备过程中需谨慎操作并采用正确的技术，以防止污染，这对实现准确检测至关重要。

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=MP0035%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-MP0035&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">LookOut 支原体 PCR 检测试剂盒&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MP0035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D9307%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-D9307&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">JumpStart Taq DNA 聚合酶&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9307</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=MP0030%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-MP0030&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">GenElute 血液基因组 DNA 提取试剂盒&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MP0030</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T0447%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-T0447&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Nunc 扩增管&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0447</td><td></td></tr></tbody></table>

优化的基于 pcr 的支原体检测

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

保持细胞系无污染对于基于细胞的研究至关重要。其中最主要的污染问题之一是支原体污染。尽管支原体通常不会杀死被污染的细胞，但其难以检测，并可对培养细胞产生多种影响，包括代谢改变、增殖减缓以及染色体畸变。简而言之，支原体污染会严重影响这些细胞系在生命科学研究中提供准确数据的价值。
实验室中支原体污染的来源非常难以完全控制。由于某些支原体种类存在于人类皮肤上，因此可能通过不当的无菌操作技术引入。此外，污染还可能来自受污染的添加剂，如胎牛血清，而最重要的是来自其他已被支原体污染的细胞培养物。一旦支原体污染了某一培养物，便可能迅速扩散至实验室的其他区域。严格遵守良好的实验室规范，例如规范的无菌操作技术，是防控的关键，同时强烈建议定期进行支原体检测，以有效控制支原体污染。
基于PCR的支原体检测已成为细胞系常规维护中非常流行的方法。基于PCR的检测方法具有高度敏感性，且能提供快速的结果，使研究人员在检测到污染后能够迅速采取措施进行隔离和清除，相较于微生物学技术所需时间大大缩短。LookOut支原体PCR检测试剂盒灵敏度极高，检测限仅为每2个基因组 &mu;利用高度特异性的JumpStart Taq DNA聚合酶及专有的引物设计，可大幅降低假阳性结果。便捷的8管格式、预涂有dNTP的管条以及配套引物，有助于提高通量，满足拥有较多种细胞系样本的客户的需求。
由于该试剂盒具有极高的灵敏度，必须格外注意防止样本和试剂受到无意污染。我们演示的逐步操作流程强调了可靠检测支原体所需的预防措施和操作规范。我们还展示并讨论了典型结果及其解读方法。我们的目标是确保研究人员成功使用LookOut支原体PCR检测试剂盒。

LookOut支原体PCR检测试剂盒利用聚合酶链式反应（PCR），该方法被公认为检测细胞培养物及其他细胞培养来源生物制品中支原体、无胆支原体和脲原体污染的灵敏度最高的首选方法。

优化的基于 PCR 的支原体检测

无菌细胞系的维持对于基于细胞的研究至关重要。其中最主要的污染问题之一是支原体污染。

本实验的总体目标是直观展示使用优化后的“瞭望”支原体PCR检测试剂盒检测支原体污染的操作步骤。首先将样本加热至95摄氏度，以灭活可能影响目标模板适用于PCR的任何DNA分子。随后，使用预装有核苷酸、引物和内参DNA的试剂管对样本进行PCR前处理。该实验步骤的第三步是在经过精心优化的条件下进行温度循环，以获得最高的灵敏度并消除非特异性扩增。最终，可通过琼脂糖凝胶电泳分析结果，判断待测样本是否受到支原体污染。该技术相较于现有方法的主要优势在于试剂为预混式，且使用高质量的PCR管。这使得操作更加方便和高效。该试剂盒的另一个优势在于，每微升样本中只需含有不到两个支原体基因组即可检测出污染。在进行支原体检测操作时，应尽量避免任何可能的污染，适当使用个人防护装备以最大限度减少皮肤暴露，确保所用的所有试剂均无污染，并始终维持规范的无菌操作技术。该实验步骤可直接用于细胞培养上清液，也可将样品制备后于日后使用。若需制备样品以供后续使用，请取每种上清液100 µL加入无菌扩增管中，在95 °C孵育5分钟。孵育结束后，样品可在2至8 °C保存最多一周。在检测样品前，短暂离心以沉淀任何细胞碎片。为准备PCR样品，首先确定反应所需的DNA聚合酶重悬缓冲液体积。每个反应应加入一单位DNA聚合酶至适量的重悬缓冲液中，缓冲液体积因所用TAC而异。本实验中使用的TAC为Jumpstart TAC D 93 0 7，共进行五个反应，包括三个样品、一个阳性对照和一个阴性对照。将计算体积的DNA聚合酶加入一个洁净的微量离心管中，随后加入计算体积的复溶缓冲液。通过轻弹管壁轻轻混匀DNA聚合酶复溶缓冲液。切勿涡旋此混合液。使用试剂盒中提供的透明反应管制备阴性对照和样品。这些反应管中已含有核苷酸、引物和内参DNA，向每管中加入23 µL先前配制的DNA聚合酶重悬缓冲液。在每个阴性对照和样品管中充分混匀。然后向阴性对照中加入 2 µL 无 DNA 水，并向相应的样本管中加入 2 µL 各样本。通过轻弹管壁混匀内容物。切勿涡旋振荡。为制备阳性对照，使用试剂盒中提供的粉色反应管。这些反应管中已含有核苷酸、引物和内对照 DNA，向反应管中加入 25 µL DNA 聚合酶重悬缓冲液混合液。通过轻弹管壁混匀内容物，切勿涡旋振荡。然后将阳性对照、阴性对照和样本管在室温下孵育5分钟。5分钟后，将所有反应管转移至热循环仪中。进行PCR时，设置以下条件，共40个循环。94 摄氏度 30 秒。55 摄氏度 30 秒，72 摄氏度 40 秒。使用 Jumpstart tack 时无需激活步骤。PCR 循环完成后，将样品从热循环仪中取出，并置于冰上冷却至 4 至 8 摄氏度。随后可直接将样品上样至琼脂糖凝胶进行电泳，每个 PCR 反应取 8 µL 加入独立的加样孔中。上样前无需额外添加上样缓冲液和染料，因为这些成分已包含在反应管中。当示踪染料迁移了2.5至3厘米时，停止电泳。本图显示了通过PCR检测支原体的代表性结果，为琼脂糖凝胶电泳的一个泳道。2号为阴性对照，应显示一条约481个碱基对的条带。在481个碱基对处未出现阴性对照条带，表明所用TAC的灵敏度不足。支原体阳性样本将在270±8个碱基对范围内出现条带，如第3至第6泳道所示。对于高度污染的样本，条带较深；而对于轻度污染的样本，条带则较浅。所有样本均包含一种内部阴性对照，以证明 PCR 反应按预期进行。在污染程度较高的样本中，内部对照条带缺失是正常现象。如第 7 泳道所示，若阳性与阴性范围均未出现条带，则表明样本存在抑制作用，这是一个良好的指示信号。如果样本受到抑制，可通过进行DNA提取去除PCR抑制物。观看本视频后，您应能够充分理解如何执行试剂盒说明中列出的所有必要步骤，并能够在必要时解读结果和排除故障。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

优化的基于PCR的检测支原体

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