优化的基于 PCR 的支原体检测

本实验的总体目标是直观展示使用优化后的“瞭望”支原体PCR检测试剂盒检测支原体污染的操作步骤。首先将样本加热至95摄氏度，以灭活可能影响目标模板适用于PCR的任何DNA分子。随后，使用预装有核苷酸、引物和内参DNA的试剂管对样本进行PCR前处理。

该实验步骤的第三步是在经过精心优化的条件下进行温度循环，以获得最高的灵敏度并消除非特异性扩增。最终，可通过琼脂糖凝胶电泳分析结果，判断待测样本是否受到支原体污染。该技术相较于现有方法的主要优势在于试剂为预混式，且使用高质量的PCR管。

这使得操作更加方便和高效。该试剂盒的另一个优势在于，每微升样本中只需含有不到两个支原体基因组即可检测出污染。在进行支原体检测操作时，应尽量避免任何可能的污染，适当使用个人防护装备以最大限度减少皮肤暴露，确保所用的所有试剂均无污染，并始终维持规范的无菌操作技术。

该实验步骤可直接用于细胞培养上清液，也可将样品制备后于日后使用。若需制备样品以供后续使用，请取每种上清液100 µL加入无菌扩增管中，在95 °C孵育5分钟。孵育结束后，样品可在2至8 °C保存最多一周。

在检测样品前，短暂离心以沉淀任何细胞碎片。为准备PCR样品，首先确定反应所需的DNA聚合酶重悬缓冲液体积。每个反应应加入一单位DNA聚合酶至适量的重悬缓冲液中，缓冲液体积因所用TAC而异。本实验中使用的TAC为Jumpstart TAC D 93 0 7，共进行五个反应，包括三个样品、一个阳性对照和一个阴性对照。

将计算体积的DNA聚合酶加入一个洁净的微量离心管中，随后加入计算体积的复溶缓冲液。通过轻弹管壁轻轻混匀DNA聚合酶复溶缓冲液。切勿涡旋此混合液。

使用试剂盒中提供的透明反应管制备阴性对照和样品。这些反应管中已含有核苷酸、引物和内参DNA，向每管中加入23 µL先前配制的DNA聚合酶重悬缓冲液。在每个阴性对照和样品管中充分混匀。

然后向阴性对照中加入 2 µL 无 DNA 水，并向相应的样本管中加入 2 µL 各样本。通过轻弹管壁混匀内容物。切勿涡旋振荡。

为制备阳性对照，使用试剂盒中提供的粉色反应管。这些反应管中已含有核苷酸、引物和内对照 DNA，向反应管中加入 25 µL DNA 聚合酶重悬缓冲液混合液。通过轻弹管壁混匀内容物，切勿涡旋振荡。

然后将阳性对照、阴性对照和样本管在室温下孵育5分钟。5分钟后，将所有反应管转移至热循环仪中。进行PCR时，设置以下条件，共40个循环。

94 摄氏度 30 秒。55 摄氏度 30 秒，72 摄氏度 40 秒。使用 Jumpstart tack 时无需激活步骤。

PCR 循环完成后，将样品从热循环仪中取出，并置于冰上冷却至 4 至 8 摄氏度。随后可直接将样品上样至琼脂糖凝胶进行电泳，每个 PCR 反应取 8 µL 加入独立的加样孔中。上样前无需额外添加上样缓冲液和染料，因为这些成分已包含在反应管中。

当示踪染料迁移了2.5至3厘米时，停止电泳。本图显示了通过PCR检测支原体的代表性结果，为琼脂糖凝胶电泳的一个泳道。2号为阴性对照，应显示一条约481个碱基对的条带。

在481个碱基对处未出现阴性对照条带，表明所用TAC的灵敏度不足。支原体阳性样本将在270±8个碱基对范围内出现条带，如第3至第6泳道所示。对于高度污染的样本，条带较深；而对于轻度污染的样本，条带则较浅。

所有样本均包含一种内部阴性对照，以证明 PCR 反应按预期进行。在污染程度较高的样本中，内部对照条带缺失是正常现象。如第 7 泳道所示，若阳性与阴性范围均未出现条带，则表明样本存在抑制作用，这是一个良好的指示信号。

如果样本受到抑制，可通过进行DNA提取去除PCR抑制物。观看本视频后，您应能够充分理解如何执行试剂盒说明中列出的所有必要步骤，并能够在必要时解读结果和排除故障。