操纵日本三角涡虫 Dugesia japonica 再生的药理学与功能遗传学实验方法

以下实验的总体目标是利用药理学和（或）基因敲低方法，在帕里安涡虫中进行并调控再生实验。第一步是掌握基本的截肢和再生实验技术。接下来展示如何使用药物干扰再生极性，例如，产生双头动物。

最后，介绍了如何通过喂食进行体内RNA干扰实验，以研究特定基因功能缺失的影响。结果表明，使用药物quintal处理会破坏再生过程，产生双头蠕虫；而对甜菜碱转运蛋白及其同工型进行基因敲低也会导致极为相似的表型。

大家好，我叫John Chan，是行军实验室的一名研究生，我将为大家演示这些实验操作。对这些方法进行可视化展示非常重要，因为尽管其中每一步单独来看都不复杂，但对刚接触该模型系统的研究人员而言，整体的操作演示将提供极大的帮助。

在进行检测之前，停止喂养约30只秀丽隐杆线虫，在饥饿条件下至少持续五天。在检测当天，线虫的体长应介于8至10毫米之间。用水冲洗一个预先调平的冰盘，并用镊子将塑料膜覆盖在平坦的冰面上。

将一张滤纸放在塑料膜上。使用移液管滴加几滴泉水润湿滤纸，然后将不超过20条线虫放置于滤纸上。如有必要，可通过再次滴加泉水重新调整线虫在滤纸上的位置。

当蠕虫处于合适位置后，使用解剖刀去除多余的液体，并在动物前端顶点与咽部前端之间约一半的位置进行单次切割，以切除头部。接着，在动物尾端与咽部后端之间约一半的位置进行单次切割，以切除尾部。每次切割后，用70%乙醇润湿的纸巾擦去解剖刀上多余的黏液，然后在再次切割前将解剖刀上的多余乙醇擦拭干净。

用镊子夹取滤膜，转移至含有泉水的培养皿中。等待约三分钟，直至伤口闭合，伤口闭合的特征为伤口处出现收缩和变暗现象。将滤纸上的躯干片段冲洗到含有再生实验所需培养基的培养皿中，并转移至设定为24摄氏度的恒温培养箱中。

约一周后评估再生表型。当可识别再生结构时，通过将药物溶于DMSO配制200毫摩尔的吡喹酮（PZ Q）储备液，并于当天新鲜使用。接着，向缓冲的Majic盐溶液中加入22.5微升PZ Q储备液，涡旋混匀约一分钟，制备50毫升含药溶液。

为确保分散，将蠕虫置于用泉水润湿的滤纸上，并按照躯干片段化再生实验所述方法切除头部和尾部区域。切除后，在伤口闭合后将躯干片段转移至含有泉水的培养皿中。更换培养基为90 µM PZ Q溶液，并将培养皿置于24 °C培养箱中。24至48小时后，将含PZ Q的培养基更换为泉水，多次洗涤蠕虫，然后将蠕虫重新放回培养箱。一周后，在进行实验前评估蠕虫的双极性或双头表型。

制备鸡肝匀浆，从食品原料中剔除脂肪状的黄色部分，然后将剩余的肝脏组织研磨成匀浆，并通过网筛过滤。将滤过的匀浆用适量水制成悬浮液后储存。接下来，通过分装将牛红细胞（RBCs）样品制备成每份1毫升，于-20摄氏度保存。

使用饥饿处理五天的线虫，并将其分为三组：目标基因组、已知具有RNAi表型的基因作为阳性对照组，以及无RNAi表型的基因作为阴性对照组。

对于每个实验组，使用约250条长度为8至10毫米的线虫。为每个实验组解冻一管表达针对目的基因的双链RNA的e coli菌液，同时准备一管鸡肝匀浆和一管红细胞（RBCs）。在13,000 ×g条件下离心1分钟，使细菌沉淀；弃去上清液，并将沉淀重悬于700 µL的2XYT培养基中。

重新离心，弃去上清液，然后将沉淀置于冰上。通过彻底剪切P200枪头末端制备一个宽口枪头，用其将细菌沉淀充分重悬于150 µL鸡肝匀浆液和50 µL红细胞中，制成RNAi饲喂混合物。短暂离心以去除气泡，用于饲喂。

从盛有蠕虫的塑料容器中移除大部分水，仅保留约一英寸深的水量。轻轻旋转容器，使蠕虫集中在容器中央。然后用移液器将RNAi饲喂混合液沿圆形路径滴加，将蠕虫围拢在其中。

使用移液管小心地将任何逃逸的个体重新引导至 RNAi 饲喂混合物上，注意在饲喂约一小时后不要干扰其他正在进食的个体，识别出进食良好的个体，并移除那些看起来进食不良的蠕虫。进食良好的蠕虫会因摄入红细胞而呈现深红色。

使用移液管小心地将蠕虫轻柔地集中到容器的一侧，以尽量减少干扰，防止其摄入食物。随后，仔细将旧的培养液倒出，并沿容器对侧壁缓缓加入新鲜的泉水，以避免长时间暴露在空气中，从而迅速重新淹没蠕虫。

也可导致食物摄入较为松散。密封容器盖子，并将蠕虫放回24°C培养箱中。在多个周期中重复此RNAi饲喂方案，并穿插再生周期，最终以筛选出RNAi表型。

此处展示了一种对许多基因均有效的标准喂养与再生时间表。F 代表喂养程序，X 代表再生检测。整个流程大约需要一个月时间，可根据不同基因进行调整，例如减少（用括号表示的 F）或增加喂养次数，因为最佳方案将取决于多种因素，如 mRNA 的稳定性、组织定位、蛋白质、P dur 或表型发展情况，这些因素可能限制再生后多次喂养周期的实施。

以下是躯干再生实验的典型结果。左侧显示了纤毛虫的图像，其上方为示意图，标明了截断切口的位置。右侧展示了躯干片段在七天内的再生过程，到第三天时眼点开始出现。

在此，通过针对 DJ 61 基因的 RNAi 并结合 PZ Q.处理对躯干片段再生进行药理学干预，获得了双头涡虫。在 FX FX 喂养方案中出现 ilis 表型，而在 FFFX 喂养方案中则导致 DJ PC 两段 RNAi 涡虫丧失避光反应，并呈现红色染色，与可移动的对照组相比表现为不动状态。另一例中，绿色染色的涡虫经 RNAi 敲低了 DJ beta catine。

采用FXFX喂养方案可诱导在后部伤口处再生出头部。通过执行这些操作步骤，研究人员将能够利用基因敲低方法或选择性药理学试剂，针对其研究中感兴趣的基因，以探索这些基因在淡水扁虫生物学及组织再生中的作用。