0 次观看 • 5:45 分钟 • July 8th, 2025
调节性T细胞（Tregs）是一类特殊的T细胞亚群，具有免疫抑制作用，可介导免疫系统的稳态。Tregs表达细胞表面标志物CD4、CD25和神经纤毛蛋白1（Nrp1），以及核转录因子forkhead box P3（Foxp3）和Helios。
为了从小鼠的胰腺引流淋巴结（PDLN）中分离调节性T细胞（Treg），将金属筛网置于锥形管上。将PDLN放置在筛网上，研磨组织以进行机械解离。在筛网上加入适量培养基，冲洗细胞进入管中。
离心，去除死细胞和细胞碎片。将活细胞重悬于培养基中。将细胞通过安装在圆底管上的细胞筛网帽过滤，以获得均一的单细胞悬液，消除任何残留的细胞团块。
加入荧光染料偶联的抗-CD4、抗-CD25和抗-Nrp1抗体。抗-CD4和抗-CD25抗体分别结合Treg细胞表面的相应抗原。同时，抗-Nrp1抗体结合Nrp1受体。
使用适当的透化固定缓冲液处理细胞，固定细胞并透化细胞膜和核膜。加入针对 Foxp3 和 Helios 的荧光染料偶联抗体。
通透化的膜可使抗体进入细胞并与相应的核内靶点结合。使用流式细胞术分析细胞。
Treg细胞的特征是细胞表面高表达CD4、CD25和Nrp1，同时核内表达转录因子Foxp3和Helios。
首先，将一个15毫升的锥形管放入试管架中。在管口上方放置一个无菌的250微米金属筛网。用1毫升RPMI冲洗筛网。接着，将淋巴结转移至该金属筛网上，使用一对镊子将其研磨过筛。在筛网上加入1毫升RPMI，以冲洗细胞进入管中。对每个样品重复上述转移和研磨淋巴结的操作共三次，然后移除筛网。
将离心管在433 × g 条件下、4摄氏度离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于约5毫升RPMI中，然后用RPMI补充满离心管。从离心样品到用RPMI补充满离心管的步骤重复一次。
将离心管再次在433 × g 条件下、4摄氏度离心5分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2毫升RPMI培养基中。取2毫升细胞悬液转移至带有细胞筛网帽的5毫升圆底管中。
首先，将来自PDLN样本的细胞悬液在433 × g、4摄氏度条件下离心5分钟。弃去上清液。按照文本方案中所述，用表面抗体对细胞进行染色，并将试管置于冰上孵育40分钟。
接下来，向每根试管中加入 200 µL FACS 缓冲液。在 4 °C 条件下以 433 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次——即再次加入缓冲液、离心并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于 500 µL 穿膜固定缓冲液中，以固定并通透细胞。
将试管转移至4摄氏度冰箱中过夜。次日，在4摄氏度条件下，以433 × g 离心PDLN样本的细胞悬液5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500微升的透化洗涤缓冲液中。再次在4摄氏度条件下，以433 × g 离心5分钟，弃去上清液。
按照文本方案中的说明，使用细胞内抗体对细胞进行染色。将各管置于冰上孵育1小时。随后，向每管中加入500 µL破膜洗涤缓冲液。在4 °C条件下，以433 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL破膜洗涤缓冲液中。
在4摄氏度下，以433 × g 再次离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于300微升FACS缓冲液中。然后，按照文本方案中所述，在流式细胞仪上分析细胞。