Name: 自动疏水层析蛋白质纯化用柱选择 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习使用自动化疏水层析柱筛选方法优化蛋白质纯化流程，通过中压液相色谱系统快速识别最佳HIC介质。该技术可显著提高重组蛋白分离效率与实验可重复性。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目 GM086822 和美国国家科学基金会重大研究仪器项目 DBI-0960313 资助。作者谨此感谢 Bio-Rad 公司的 Jon Miyake 博士与 Donna Hardy 博士以及西雅图大学的 Jennifer Loertscher 在技术方面的专业支持。部分层析试剂和补充仪器由 Bio-Rad 公司慷慨提供。

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</ol>

层析试剂及补充仪器由 Bio-Rad 提供。

液相色谱技术已被证明在制备高纯度蛋白质方面具有重要价值，这些蛋白质是开展免疫学6、生物化学7和结构学8研究所必需的。疏水相互作用色谱（HIC）纯化方法通常需要通过实验确定最佳介质，且配体结构、配体密度以及基质微球的性质均已被证明会影响色谱结果2, 3。自动柱筛选是一种高效的方法，可用于选择适合后续优化及蛋白质纯化的HIC介质4。所介绍的自动柱筛选方法可轻松适用于多种HIC蛋白质纯化策略。改变盐浓度、盐种类、盐梯度和pH值可能进一步优化纯化条件，这些关键参数的影响此前已有综述13,14。含有部分纯化目标蛋白的HIC洗脱液可进一步采用互补的色谱技术进行纯化，例如离子交换色谱（IEX）或凝胶过滤/尺寸排阻色谱9,10。
由于绿色荧光蛋白（GFP）具有独特的光吸收和发射特性，因此可通过在线检测和运行后分析方法来识别其洗脱曲线。基于此，本方案还可进一步适用于重组GFP融合蛋白的纯化，其中将目标蛋白与GFP进行“标记”。GFP标记的目标蛋白可通过紫外光检测11，并利用多种色谱方法进行纯化，包括上述的疏水相互作用色谱（HIC）纯化策略。此外，GFP的纯化已成为生物化学实验教学中的经典内容，广泛用于讲授现代蛋白质科学技术12。
尽管使用性能较弱的色谱系统也可进行基本的疏水相互作用层析（HIC）蛋白纯化，但本文所介绍的仪器系统在获得理想实验结果方面具有多项显著优势。使用高度自动化系统的显著优点包括：提高了运行间条件的重现性、节省时间，并减少了空气进入系统的可能性10。由系统增强模块（system maximizer）支持的系统控制缓冲液混合功能，有助于提高缓冲液配制的一致性和实验的可重复性。在所有预实验运行中，将足量样品加载至动态样品环中，可进一步确保加入每根层析柱的样品均一，并支持连续运行而无需中断或手动重新加样。通过样品环将样品可控地注入层析柱，可降低手动加样可能带来的变异性。成对的层析柱选择阀允许连续进行样品运行，每次使用不同的HIC层析柱，而无需重新连接管路。多波长分析在检测具有独特分光光度特征的蛋白质时尤为有利。除绿色荧光蛋白（GFP）外，细胞色素、黄素蛋白以及其他含血红素的蛋白质也可能从该技术中受益。电导率和pH监测装置可用于实时验证实验条件。分流式组分收集功能可改善组分处理，并便于将少量样品转移至后续分析方法（如ELISA、SDS-PAGE、Western印迹和Experion微流控电泳）。尽管第二台组分收集器离线操作需要手动同步，但这提供了在选择组分收集器时的最大灵活性。使用如此高性能的色谱系统进行HIC层析柱筛选和蛋白纯化最主要的缺点是仪器购置和操作人员培训所需的初始时间和经费投入。
本文所述方案采用 Bio-Rad DuoFlow 层析系统；然而，其他厂商生产的性能相当的仪器，例如 GE Healthcare 的 ÄKTA Avant，同样可以使用，并能够获得等效的结果。即使类似的层析系统也具有各自独特的特性（如方法编程、组件命名、操作者偏好以及可放大性限制），在启动纯化程序或采购仪器之前应予以充分考虑。

<table><tbody><tr><td>BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>7602257</td><td>包含系统增强模块、混合器、F10 工作站、AVR7-3 阀、带流通池的 QuadTec UV/Vis 检测器、BioFrac 组分收集器、BioLogic 软件和入门套件</td></tr><tr><td>AVR9-8 流路选择阀</td><td>Bio-Rad</td><td>7600408</td><td></td></tr><tr><td>分流阀 SV3-2</td><td>Bio-Rad</td><td>7500410</td><td></td></tr><tr><td>流路分流阀</td><td>Bio-Rad</td><td>7410017</td><td></td></tr><tr><td>DynaLoop 25 套件</td><td>Bio-Rad</td><td>7500451</td><td></td></tr><tr><td>BioFrac 组分收集器</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>使用两个组分收集器</td></tr><tr><td>BioFrac 微孔板滴加头适配器</td><td>Bio-Rad</td><td>74010088</td><td></td></tr><tr><td>BioFrac 微量滴定板适配器</td><td>Bio-Rad</td><td>7410017</td><td></td></tr><tr><td>紫外光学模块</td><td>Bio-Rad</td><td>7500202</td><td></td></tr><tr><td>卤素灯</td><td>Bio-Rad</td><td>7601331</td><td></td></tr><tr><td>Econo 梯度泵</td><td>Bio-Rad</td><td>7319001</td><td></td></tr><tr><td>Experion 系统</td><td>Bio-Rad</td><td>7007001</td><td></td></tr><tr><td>Experion Pro260 分析试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>7007102</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap HIC 柱筛选试剂盒</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4110-07</td><td>包含 7 支 1 ml 预装 HIC 介质的层析柱，用于条件筛选</td></tr><tr><td>GE Healthcare 至 Bio-Rad 柱接头</td><td>GE Healthcare</td><td>18111251 和 18111257</td><td></td></tr></tbody></table>

自动疏水相互作用色谱柱筛选在蛋白质纯化中的应用

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

与其他蛋白质纯化色谱方法（如凝胶过滤、亲和层析和离子交换层析）不同，疏水相互作用色谱（HIC）通常需要通过实验确定（称为筛选或“ scouting”）以选择最适合纯化特定蛋白质的色谱介质1。本文所述方法介绍了一种自动化的策略，用于筛选最适合蛋白质纯化的HIC介质。
疏水相互作用层析（HIC）根据蛋白质和其他生物分子疏水性的差异，从粗裂解液中将其分离。与亲和层析（AC）和离子交换层析（IEX）类似，HIC 在层析过程中能够对目标蛋白进行浓缩。最适合采用 HIC 进行纯化的蛋白质通常具有疏水性表面区域，并能够耐受高于 2 M 的硫酸铵（(NH4)2SO4）盐浓度。当目标蛋白缺乏亲和标签而无法使用 AC，或 IEX 无法实现充分纯化时，HIC 常被选为纯化方法。蛋白质表面的疏水基团会暂时结合到连接于惰性、不溶性基质上的非极性配体。蛋白质与配体之间的相互作用高度依赖于流经层析柱的缓冲液中的盐浓度：高离子强度可增强蛋白质与配体的结合，使蛋白质保持不移动状态（即结合在柱内）2。随着盐浓度降低，蛋白质与配体之间的相互作用减弱，蛋白质重新变为可移动状态并从柱中洗脱出来。目前市面上有多种预装柱形式的 HIC 介质，每种介质均含有不同的疏水性配体（例如 S-丁基、丁基、辛基和苯基），以不同密度交联于特定直径的琼脂糖微球上3。通过自动化的柱筛选系统，可高效地确定在后续更深入的优化实验及蛋白质纯化过程中应选用的 HIC 介质4。
此处纯化的特定蛋白为重组绿色荧光蛋白（GFP）；然而，该方法也可适用于纯化具有一个或多个疏水表面区域的其他蛋白。由于GFP具有稳定性、在397 nm处独特的光吸收峰以及在紫外光照射下产生荧光的特性，因此是一种有用的模型蛋白5。含有野生型GFP的细菌裂解液在高盐缓冲液中制备后，加载至Bio-Rad DuoFlow中压液相色谱系统，并吸附到含有不同疏水相互作用层析（HIC）介质的HiTrap HIC柱上。蛋白从层析柱中洗脱，并通过在线及运行后检测方法进行分析。缓冲液梯度混合、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能增强了系统的操作灵活性及实验方法的可重复性。

本文介绍了一种用于自动筛选适用于蛋白质纯化过程中疏水相互作用色谱（HIC）介质的自动化方法。该方法采用中压液相色谱系统，包含自动缓冲液配制、动态样品环进样、顺序柱切换、多波长分析以及分流收集洗脱组分等功能。

与纯化蛋白质的其他色谱方法（如凝胶过滤、亲和层析和离子交换）相比，疏水相互作用……

本实验的总体目标是利用自动化筛选方法，结合伯乐DUO流体中压液相色谱系统，为纯化重组蛋白选择最优的疏水相互作用（HI）液相色谱柱。首先制备所需的缓冲液以及含有目标重组蛋白的细菌裂解液；随后对DUO流色谱系统进行物理安装、管路连接，并为筛选方案做好准备。然后上样，并运行预设的高离子强度（HI）柱筛选方法，以收集目标组分样品。最后，分析EIT结果，并根据观察到的分离特性确定最佳的HI柱和介质。最终，可获得结果，明确适用于目标蛋白大规模纯化的首选HI柱介质，该过程通过DUO flow自动化的HI柱筛选功能结合中压液相色谱实现。与传统的手工柱层析连续操作等现有方法相比，该技术的主要优势在于自动化过程能够降低变异性和确保高度可重复的结果。通常，初学者可能因现代液相色谱系统的物理复杂性而遇到困难，但这些困难很容易克服。经过充分练习后，本实验操作将由本实验室的两名学生 Orange Stone 和 Shelly Anderson 进行演示。首先，准备以下缓冲液各 500 毫升：200 毫摩尔的磷酸钠溶液作为缓冲液 A1，200 毫摩尔的磷酸氢二钠溶液作为缓冲液 A2，以及 4.8 摩尔的硫酸铵溶液。缓冲液 B1 使用去离子水。对所有缓冲液进行脱气处理，以确保色谱系统的最佳运行条件。系统将混合缓冲液 A1 和 A2，生成低盐磷酸盐洗脱缓冲液；同时混合缓冲液 B1 和 B2，生成高盐硫酸铵溶液。起始缓冲液。通过将含有目标蛋白的10毫升细胞裂解液与10毫升缓冲液B2混合，制备20毫升待上样样品。细胞裂解液样品溶液的终硫酸铵浓度应约为2.4摩尔，使其大致与起始缓冲液相当。将裂解缓冲液混合物通过低蛋白结合的0.45微米注射式滤器过滤，以去除溶液中的不溶性颗粒。样品在上样前需始终保持在冰上。色谱系统的物理装置与管路连接是本实验步骤中最复杂的环节之一。根据此处所示示意图搭建双流色谱系统。确保整个实验流程中有足量的缓冲液，并且管路始终保持浸没状态。按照此处所示连接样品加载阀和动态样品环，将样品环连接至样品阀进样口的第三位置。准备八对尺寸相同的外径为1/16英寸的峰管。然后将这八对峰管连接至两个柱选择阀的第1至第8位置。打开紫外检测器灯并确认所有检测器均已校准后，按照此处所示连接组分收集器的分流阀和分流控制器。将第二位置的组分收集器分流阀和分流控制器设置为在色谱工作站之外运行。将分流百分比设为10。将第二位置组分收集器上的标准收集管滴头更换为微孔板滴头。冲洗样品环并清洗色谱系统。然后手动启动流速为每分钟一毫升的洗脱缓冲液流过系统。将一毫升高截留量 HI 柱连接至柱选择阀的第二至第八位。拆下连接位置二柱选择阀的接头。将上游柱接头连接到双流装置上。让洗脱缓冲液流经接头，直至所有空气被排出，并有大量缓冲液滴出现。接下来，取下连接到柱子入口的塞子，并在柱子顶部加入一大滴低盐缓冲液。然后将柱子连接到上游接头。将出口连接到下游柱接头和选择阀管路。将背压限值设为 40 PS.I，以每分钟 1 毫升的流速用五倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子。再以每分钟 1 毫升的流速用 10 倍柱体积的起始缓冲液洗涤柱子。待pH紫外检测基线和反压稳定后，手动将柱选择阀切换至位置一，并停止缓冲液流动。为上样，将样品进样管浸入20毫升样品中，随后将样品环加载清洗阀切换至位置一，样品上样阀切换至清洗（purge）位置。启动样品环加载泵，以每分钟1毫升的流速将样品吸入泵管中，直至样品刚到达样品加载阀为止。将样品加载阀从冲洗位切换至加载位。从生物软件的设置窗口重新启动样品环加载泵，以每分钟1毫升的流速继续运行，直至动态样品环中已吸入10毫升样品。选择本表格中带有星号标记的系统设备。接下来，选择六根HIC柱用于分析程序。通过线性递减盐梯度和六柱初筛法，手动启动起始缓冲液流速为每分钟1毫升。程序方法运行开始后，立即在离线96孔板组分收集器的屏幕控制面板上点击“开始”，同时在分流控制器上按下开始，以实现90%至10%的EIT流分流。观察实时显示，确认预期的运行参数。通过比较GFP特异性的397纳米吸光度曲线与总蛋白280纳米吸光度曲线，评估不同HI介质条件下的相对分离与纯化效果。可从96孔板各组分中取出5至50微升等分试样，转移至新的孔板，通过ELISA或Western blot检测目标蛋白含量，并利用SDS-PAGE或Experian微流控电泳系统检测总蛋白含量。此处展示了 scouting 实验中典型的高盐梯度电导率及柱压变化情况。通过高盐缓冲液管路中引出的缓冲液百分比所测得的盐浓度变化是HI方法的典型特征。随着盐浓度降低，结合在柱上的蛋白质会洗脱出来，电导率随之变化，而观察到的盐浓度是在四极技术检测器和紫外检测器之后立即在线测量的。盐浓度梯度与电导率曲线之间的偏移反映了缓冲液从缓冲液入口流经系统到达电导监测器所需的时间。在整个样品运行过程中，系统压力和pH值保持相对恒定。该图显示了连续进行的HI柱初筛实验的色谱图，以及总蛋白的在线检测结果。NGFP通过分别测量280纳米和397纳米波长处的光吸收来实现。可以估算每次初步分离实验中相对的GFP丰度和分离情况。通过比较本图中的两条曲线，对茴香FF初步分离实验的第10、12、14、16和18组分的培养管分别在自然光或荧光室内光以及紫外光下进行观察，并从正面和顶部两个角度观察紫外光下的试管，以观察特征性的GFP发射光谱。结果表明，GFP在第14组分中明显被检测到。在两张紫外光图像中，左侧紫外光图中弥散的蓝色光来自紫外灯本身发出的光。这些运行后的数据与通过在 397 纳米处测量洗脱液吸光度对 GFP 进行的在线检测结果吻合良好，后者同样鉴定出第 14 管中含有主要的 GFP 峰。完成此步骤后，还可进行其他方法，如 Western 印迹、ELISA、原子力显微镜和生物化学重建实验，以回答与目标蛋白纯度及其功能活性相关的其他问题。在尝试该实验流程时，重要的是要牢记在方法的多个步骤中需要手动控制双流系统。例如，包括缓冲液补充和样品上样、检查是否存在气泡，以及根据需要开启或关闭检测灯。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用液相色谱系统进行自动筛选，以确定最优的高离子强度（HI）色谱柱和介质。通过该原位分析和柱层析评估，研究人员可选择适合的层析柱用于后续放大纯化，还可与其他层析方法联用，以提高目标蛋白的纯度和得率。

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