自动疏水相互作用色谱柱筛选在蛋白质纯化中的应用

本实验的总体目标是利用自动化筛选方法，通过伯乐DUO流式中压液相色谱系统，为纯化重组蛋白选择最适的疏水相互作用（HI）液相色谱柱。首先制备所需的缓冲液以及含有目标重组蛋白的细菌裂解液；随后对DUO流式色谱系统进行物理搭建、管路连接，并完成筛选方案的准备工作。

然后上样，并运行预设的高离子强度（HI）柱筛选方法，以收集馏分样品eit。最后，分析EIT，并根据观察到的分离特性确定最佳的HI柱和介质。最终，可获得结果，显示通过DUO flow自动化HI柱筛选功能，利用中压液相色谱法，为研究者的目标蛋白的放大纯化优选出的HI柱介质。

与现有的手动柱层析连续操作等方法相比，该技术的主要优势在于自动化过程可降低变异性，并确保获得高度可重复的结果。通常，初学者可能因现代液相色谱系统的物理复杂性而遇到困难，但这些问题可以很容易地掌握和克服。

经过充分练习后，本实验操作将由本实验室的两名学生 Orange Stone 和 Shelly Anderson 进行演示。首先，准备以下缓冲液各 500 毫升：200 毫摩尔的磷酸钠用于缓冲液 A1，200 毫摩尔的磷酸氢二钠用于缓冲液 A2，以及 4.8 摩尔的硫酸铵。缓冲液 B2 中，去离子水将作为缓冲液 B1。对缓冲液进行脱气处理，以确保色谱系统的最佳运行条件。系统将混合缓冲液 A1 和 A2，生成低盐磷酸盐洗脱缓冲液；同时混合缓冲液 B1 和 B2，生成高盐硫酸铵溶液。

起始缓冲液。通过将含有待纯化蛋白的10毫升细胞裂解液与10毫升缓冲液B2混合，制备20毫升待上样样品。细胞裂解液样品溶液的终浓度硫酸铵应约为2.4摩尔，使其大致与起始缓冲液相当。

将裂解缓冲液混合物通过低蛋白吸附的0.45微米注射器滤器过滤，以去除溶液中的不溶性颗粒。样品在上样至系统前应始终保持在冰上。色谱系统的物理装置和管路连接是该实验步骤中最复杂的环节之一。

根据此处所示示意图搭建双流层析系统。确保整个实验流程中有足量的缓冲液，并且管路始终保持浸没状态。按照此处所示连接样品加载阀和动态样品环，将样品环连接至样品阀进样口的第三位置。

准备八对尺寸相同的外径为1/16英寸的峰管。然后将这八对峰管连接至两个柱选择阀的第1至第8位置。打开紫外检测器灯并确认所有检测器均已校准后，按照此处所示连接组分收集器的分流阀和分流控制器。

第二位置的组分收集器分流阀和分流控制器在色谱工作站之外操作。将分流比例设置为10%。将第二位置组分收集器上的标准组分收集器落液头更换为微孔板落液头。

冲洗样品环并清洗色谱系统。然后启动手动流速为每分钟一毫升的洗脱缓冲液流过系统。将一毫升高截留量 HI 柱连接至柱选择阀的第二至第八位置。

拆下连接位置二的柱选择阀的接头。将上游柱接头连接至双流装置。让洗脱缓冲液流经接头，直至排尽所有空气，并有大量缓冲液液滴出现为止。

接下来，取下连接到柱子入口的塞子，并在柱子顶部放置一大滴低盐缓冲液。然后将柱子连接到上游接头。将出口连接到下游柱接头和选择阀管路。

将背压限值设为 40 PS.I，以每分钟 1 毫升的流速用五个柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子。再以每分钟 1 毫升的流速，用 10 个柱体积的起始缓冲液洗涤柱子。

当pH紫外检测曲线和反压稳定后，手动将柱选择阀切换至位置一，并停止缓冲液流动。要加载样品，需将样品进样管浸入20毫升样品中。然后将样品环加载清洗阀切换至位置一，将样品加载阀切换至清洗模式。

启动样品环加载泵，以每分钟1毫升的流速将样品吸入泵管中，直至样品刚到达样品加载阀为止。将样品加载阀从冲洗位切换至加载位。从生物软件的设置窗口重新启动样品环加载泵，以每分钟1毫升的流速继续运行，直至动态样品环中已吸入10毫升样品。

选择本表格中带有星号标记的系统设备。接下来，选择六根HIC柱用于分析程序。通过线性递减盐梯度和六柱初筛法，手动启动缓冲液流动，流速为每分钟一毫升。

启动分流控制器上的“开始”按钮，在程序方法运行开始后立即进行90%至10%的EIT流分流。在离线96孔板组分收集器的屏幕控制面板上按下“开始”按钮。观察实时显示以确认预期的运行参数。通过比较GFP特异性的397纳米吸光度曲线与总蛋白的280纳米吸光度曲线，评估不同HI介质条件下的相对分离与纯化效果。可从96孔板各组分中取出5至50微升的等分试样，转移至新的孔板，并通过ELISA或Western印迹法检测目标蛋白含量，同时使用SDS-PAGE或Experion微流控电泳系统检测总蛋白含量。此处展示了预实验中典型的盐梯度电导率及柱压结果。

通过高盐缓冲液管路中引出的缓冲液百分比所测得的盐浓度变化，是高盐洗脱（HI）方法的典型特征。随着盐浓度降低，结合在柱上的蛋白质随之洗脱，电导率也随之变化，所观测到的盐浓度是在四通道技术（quad tech）和紫外检测器（UV detectors）之后立即在线测量的。盐梯度与电导率曲线之间的偏移反映了缓冲液从缓冲液入口流经系统到达电导监测器所需的时间。

在整个样品运行过程中，系统压力和pH值保持相对恒定。该图显示了连续进行的HI柱筛选运行的色谱图以及总蛋白的在线检测结果。NGFP通过分别测量280纳米和397纳米波长处的光吸收来实现。

可以估算每次初步分离实验中相对的GFP丰度和分离情况。通过比较本图中的两条曲线，对茴香FF初步分离实验的第10、12、14、16和18组分的培养管分别在自然光或荧光室内光以及紫外光下进行观察，并且紫外光下的样品分别以正面和俯视角度观察，以检测特征性的GFP发射光谱。结果表明，GFP在第14组分中被明显检测到。在两张紫外光图像中，左侧紫外光图中弥散的蓝色光来自紫外灯本身的发射光。

这些运行后的数据与通过在 397 纳米处测量洗脱液吸光度对 GFP 进行的在线检测结果高度一致，后者同样鉴定出第 14 组分含有目标 GFP 的主要峰。完成此步骤后，还可进行其他方法，如 Western 印迹、ELISA、原子力显微镜和生物化学重组实验，以回答与所纯化蛋白质的纯度及其功能活性相关的其他问题。

在尝试该实验流程时，重要的是要牢记在方法的多个步骤中需要手动控制双流系统。例如，包括缓冲液补充和样品上样、检查是否存在气泡，以及根据需要开启或关闭检测灯。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用液相色谱系统进行自动化筛选，以确定最适的高离子强度（HI）色谱柱和介质。

通过原位分析和柱效评估，研究人员可选择适合的色谱柱用于后续放大纯化，该方法还可与其他色谱技术联用，以提高目标蛋白的纯度和得率。