Name: 椎管内针对肌萎缩性脊髓侧索硬化症和外伤性脊髓损伤颈腹角细胞移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习神经前体细胞移植技术，用于脊髓损伤和肌萎缩性脊髓侧索硬化症研究。该方法通过椎板切除术将细胞精准注入颈段脊髓腹角，保护膈运动神经元功能。

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我要感谢：Lepore、Maragakis 和 Rothstein 实验室的所有成员，感谢他们有益的讨论；感谢美国瘫痪退伍军人协会和 Craig H. Neilsen 基金会提供的经费支持。

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
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<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
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<li>Shumsky, J. S., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Neuronal+and+Glial+Restricted+Precursors+into+Contused+Spinal+Cord+Improves+Bladder+and+Motor+Functions%2C+Decreases+Thermal+Hypersensitivity%2C+and+Modifies+Intraspinal+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry.</a> J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在涉及 SOD1G93A 小鼠和大鼠的研究中，应确保组内动物的年龄和性别相匹配，并将同窝出生的动物分配至不同组别。在 ALS 和 SCI 模型中，优先使用同一性别的动物，因为疾病进程在雄性和雌性之间可能存在差异；然而，纳入足够数量的两种性别动物也可能有助于检测潜在的性别特异性效应，该现象已在 SOD1G93A 大鼠13 和 SOD1G93A 小鼠14,15 中有报道。在将细胞移植到动物体内时，需考虑动物的年龄/疾病阶段（针对 ALS 动物）或损伤后的时点（针对 SCI 模型）。该策略可能因所研究的具体细胞机制不同而有所差异。
本文所述方案可用于大鼠和小鼠的颈段脊髓11，也可用于将细胞移植至大鼠和小鼠脊髓的其他节段，如胸段和腰段脊髓14。为了准确靶向这些不同脊髓节段中的特定解剖结构（除前角以外），建议首先使用染料或其他方法检测注射的内外侧位置和深度，以评估坐标定位的准确性。
<p class="jove_content"...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂（可选）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6522</td><td></td></tr><tr><td>马来酸乙酰丙嗪（0.7 mg/kg）</td><td>Fermenta Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮（95 mg/kg）</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（10 mg/kg）</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 羽毛手术刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72044-11</td><td></td></tr><tr><td>棉签（6 英寸）</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>鼠齿镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>大鼠：11023-15；小鼠：11042-08</td><td></td></tr><tr><td>中型弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>小型弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>大鼠：16121-14；小鼠：16221-14</td><td></td></tr><tr><td>显微刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12502-14</td><td></td></tr><tr><td>缝线：4-0</td><td>Vicryl</td><td>S-183</td><td></td></tr><tr><td>钉合钉：9 mm</td><td>Autoclip</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>钉合器：9 mm（Reflex #203-1000）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>5000344</td><td></td></tr><tr><td>温水泵（T/Pump）</td><td>Gaymar Industries</td><td>P/N 07999-000</td><td></td></tr><tr><td>环孢素 A：250.0 mg/5.0 mL 安瓿</td><td>Novartis AG</td><td>NDC 0078-0109-01</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>LC Laboratories</td><td>F-4900</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>LC Laboratories</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP2</td><td></td></tr><tr><td>Micro 4 微量注射泵控制器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMC4</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Kite-R</td><td></td></tr><tr><td>10.0 &amp;mu;L Hamilton 注射器</td><td>Hamilton Co</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 针头：33 号规格，45&amp;#x00B0; 斜面，1 英寸</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>玻璃 20.0 &amp;mu;L 微量毛细移液管（可选）</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-20</td><td></td></tr></tbody></table>

脊髓内细胞移植用于靶向治疗肌萎缩侧索硬化症和创伤性脊髓损伤中的颈段腹角

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

由于膈肌运动神经元丧失导致的呼吸功能受损是大多数人类创伤性脊髓损伤（SCI）病例中的一种致残性后果1，也是运动神经元疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者死亡的最终原因2。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种破坏性的神经系统疾病，其特征是上、下运动神经元相对较快地退化。由于膈肌的膈神经运动神经元支配丧失导致呼吸麻痹，患者通常在确诊后平均2-5年内死于该病3。绝大多数病例为散发性，仅有10%为家族性类型。约20%的家族性病例与21号染色体上的铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1）基因的多种点突变相关4。目前已培育出携带突变人源SOD1基因（G93A、G37R、G86R、G85R）的转基因小鼠4,5和大鼠6，尽管还存在其他运动神经元丢失的动物模型，但这些转基因动物模型仍是目前应用最广泛的疾病模型。
脊髓损伤（SCI）是一组由脊髓物理性创伤引起的异质性病症，其功能预后因损伤的类型、部位和严重程度而异7。然而，大约一半的人类SCI病例影响颈段脊髓，导致膈肌运动神经元丧失以及下行球脊呼吸轴突受损，从而引发严重的呼吸功能障碍1。目前已开发出多种脊髓损伤的动物模型，其中最常用且具有临床相关性的是挫伤模型8。
由于神经前体细胞（NPCs）具有替代丢失或功能异常的中枢神经系统细胞类型、提供神经保护以及递送目的基因因子的能力，因此移植多种类别的神经前体细胞被认为是治疗创伤性中枢神经系统损伤和神经退行性疾病（包括肌萎缩侧索硬化症和脊髓损伤）的一种有前景的治疗策略9。
肌萎缩侧索硬化（ALS）和脊髓损伤（SCI）的动物模型能够模拟这些疾病的多种临床相关特征，包括膈肌运动神经元的丧失及其导致的呼吸功能受损10,11。为了评估基于神经前体细胞（NPC）的治疗策略在这些ALS和SCI动物模型中对呼吸功能的疗效，必须将细胞干预精准地靶向至包含治疗相关靶点（如膈肌运动神经元）的特定区域。本文提供了一种详细的实验方案，用于在神经退行性疾病模型（如SOD1G93A小鼠和大鼠）以及脊髓损伤的大鼠和小鼠中，将NPC多节段地移植至颈段脊髓腹侧灰质11。

神经前体细胞移植是一种有前景的策略，可用于保护和/或替代脊髓损伤（SCI）及运动神经元病——肌萎缩侧索硬化症（ALS）中丧失或功能异常的颈段膈运动神经元。本文提供了在ALS和SCI啮齿类动物模型中，将细胞递送至颈段脊髓前角的实验方案。

由于膈肌运动神经元丧失导致的呼吸功能受损是人类创伤性脊髓损伤（SCI）中相当大比例病例的致残性后果……

本实验的总体目标是将多节段脊髓内移植神经前体细胞靶向至大鼠和小鼠颈椎脊髓的腹侧灰质。首先准备用于移植的特定神经前体细胞类型，随后在预定细胞移植位点对脊髓进行椎板切除术，从而实现上述目标。接下来，将细胞准确地注射到相应的位置和深度，以精确靶向颈段脊髓前角的细胞递送。最后一步是持续对动物进行免疫抑制处理，直至动物被处死，以确保移植细胞在脊髓内存活。最终，可通过免疫组织化学及后续显微镜分析等组织学方法，在移植后的不同时间点获取数据，用于追踪移植的神经前体细胞在成年颈段脊髓中的存活、迁移和分化情况。本方法中的可视化演示至关重要，因为许多复杂的脊髓手术和细胞移植步骤难以掌握，这些操作需要格外谨慎和特定的技术，而通过可视化则可使其更易于学习。若采用推荐的操作流程，应在移植前3天开始，通过皮下注射的方式，每天给予动物10毫克/千克体重的环孢素A，以实现免疫抑制。若移植的是啮齿类动物来源的细胞，则需通过腹腔注射的方式，每天给予动物每千克体重1毫克的FK506和雷帕霉素。如果需要移植人体来源的细胞，则还需将坚固的回形针弯曲成拉钩。折下回形针的一部分以制成钩状，并将回形针的另一端弯成一个小环。然后将细线穿过每个拉钩上的小环，在手术当天对手术所需的所有器械、拉钩以及细线进行高压灭菌。根据书面实验方案中的步骤，准备待移植的胶质前体细胞或其他细胞的分装样品。细胞收获后，将细胞悬液分装至多个1.5毫升微量离心管中，并置于湿冰上保存。然后对动物实施适当的麻醉方法，通过脚趾夹捏试验确认已达到适合手术的麻醉深度。使用电动剃须刀剃除动物背部的毛发，剃毛区域应从略靠前于耳部的位置至动物背部中段，并彻底清除皮肤表面的剪下的毛发，以防毛发进入切口。接着，用一片纱布浸透聚维酮碘消毒液后敷于剃毛区域的皮肤上。以消毒液至少环形擦拭两次，再用酒精或稀释的消毒剂环形擦拭至少两次。从切口部位开始，向外朝向发际线进行操作。将一块无菌卷起的纱布垫放置在干净的手术板上，并用胶带将纱布垫固定在板上，防止其移动。将动物置于卷起的纱布上，呈屈曲体位。将动物的双臂在垫子上伸展开，然后用胶带将双臂固定在垫子和手术板上，以支撑起颈脊髓。由于颈脊髓位于皮肤表面深处，这样做可在整个手术过程中更便于操作。此操作过程中必须使用无菌手术巾，但出于演示目的，视频中未显示。首先，在使用手术显微镜并调至最低放大倍数下观察的同时，用一把锋利的无菌手术刀从颅底至肩胛骨处做一条正中切口。然后切开脊柱上方的三层肌肉。施加适当压力，以最少的切割次数切透所有肌肉层，但不要用力过猛，以免使用两个棉签时损伤深层组织。使用旋转动作将表层肌肉与椎旁肌分离。切勿切割或撕裂肌肉，以免引起出血。将四个自制拉钩放置到位以牵开肌肉。然后将四个牵开器分别拉向四个角，并用胶带将牵开器的线固定在板上以固定牵开器。最终暴露区域应呈方形或矩形。使用鼠齿镊和中等大小的弹簧剪，剥离椎骨背侧表面的椎旁肌。紧贴骨骼进行切割，以充分暴露骨面。确保切口与椎骨表面平行，但不得深入脊髓。将中号弹簧剪更换为骨剪。然后用鼠齿钳夹住第二颈椎（C2）突起处的肌肉，固定整个脊柱，并用剪刀在第四颈椎（C4）、第五颈椎（C5）和第六颈椎（C6）水平剥离肌肉。接着在第五颈椎（C5）开始椎板切除术。再次使用鼠齿钳夹住第二颈椎（C2）以固定操作区域。用持骨钳夹住整个椎板，并调整持骨钳的位置，使工具完全垂直于脊柱的轴线。缓慢而轻柔地压碎椎板，注意不要向下压迫脊髓。然后轻轻向上提起破碎的骨块。接下来，将探针垂直于脊柱放置。然后以与脊髓表面呈30至60度的角度，将探针轻轻插入骨下。进行小切口，以扩大椎板切除范围至全部C4至C6椎板。不要将椎板切除术过度向侧方延伸，否则会引起出血。将显微镜放大倍数增加至约 15 ×，并对准脊髓。使用直头锐器。使用5号镊子清除硬脊膜表面的结缔组织。然后使用微型弹簧剪或显微刀具沿脊髓纵轴平行方向切开硬脊膜。在背根入口区内侧稍近中线的位置，确保硬脊膜在注射部位被刺穿。穿刺后，脑脊液会流出，需用纱布或棉签吸干脊髓表面及整个暴露区域的液体。用镊子夹住硬脊膜并轻轻提起，使其与脊髓分离，注意不要夹伤或损伤脊髓。使用10微升Hamilton gast型可拆卸针头注射器，沿头侧脊髓轴方向略微延长切口。安装有锋利的33号针头、45度斜面的金属Hamilton针头。缓慢吸取一个注射位点所需的细胞悬液体积。在显微镜下观察针尖行进过程的同时，将针尖缓慢下降至脊髓背侧表面。将注射器与脊柱的轴线对齐，以准确定位目标解剖区域，使针头尽可能接近90度角，并位于背根丝入口区的稍内侧。用针尖轻轻接触脊髓表面，略微下压脊髓。然后回撤针头，直至脊髓恢复至正常位置。使用显微操作器上的标尺将此位置记录为 Z 等于 0.0。接下来，通过显微镜目视监测进针过程，将针头略微降低进入脊髓。将针头降低 1.5 毫米，以定位成年大鼠的腹角。在开始注射前，将针头留置原位 2 至 5 分钟。在此期间，确保手术装置不受干扰。随后，使用泵控制器以恒定速度在 2 至 5 分钟内注入 2 µL 细胞。注射完成后，再次将针头留置原位 2 至 5 分钟。然后小心地将针头从脊髓中撤出。对其他靶向位点重复注射过程。所有靶向位点注射完毕后，将显微镜调回最低放大倍数并进行缝合。在头侧脊髓轴的三个位置，使用4-0缝线一次性闭合所有三层覆盖的肌肉。使用9毫米的伤口夹将皮肤夹闭，确保伤口夹之间的间距约为0.5厘米。使用持针器压紧伤口夹，以防止动物在伤口完全愈合前将夹子扯掉。用浸有聚维酮碘溶液的纱布涂抹切口部位，并将动物置于循环温水垫上使其从麻醉中恢复。持续每日注射环孢素A或他克莫司（FK506）、雷帕霉素，直至处死。50,000只小鼠已到达。将胶质前体细胞移植至SOD1-G93A大鼠脊髓C4节段的腹角区域。该图像显示，M二阳性小鼠在移植后一个月时，移植的细胞得以存活，并且细胞定位于腹侧灰质，但注射位点在内侧偏离了外侧腹角，如图中虚线所示。如图所示，向该区域注射大量细胞会导致注射部位及针道沿途组织损伤。一旦掌握该技术，若操作得当，六个注射位点的手术可在约45至60分钟内完成。

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椎管内针对肌萎缩性脊髓侧索硬化症和外伤性脊髓损伤颈腹角细胞移植

详细描述了将小鼠神经干细胞（NSCs）移植到已建立脱髓鞘模型的小鼠脊髓中的过程。内容包括神经干细胞的制备、胸椎第9节（T9）椎板切除术以及神经干细胞的移植操作，同时涵盖了小鼠术前和术后的护理措施。...

小鼠神经干细胞手术移植至嗜神经性小鼠肝炎病毒感染小鼠脊髓的实验方法

来源：Zweckberger, K., et al. 神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用。 J. Vis. Exp.

在大鼠模型中注射自组装肽和神经前体细胞以修复脊髓损伤

含有生长因子的纤维蛋白基质被用于将移植的神经干细胞固定在完全性脊髓横断损伤部位。移植的细胞完全填充了损伤空腔，并分化为多种神经细胞类型，包括能够向宿主脊髓长距离延伸轴突的神经元。...

严重脊髓损伤后使用纤维蛋白与生长因子混合物促进神经干细胞的存活与分化

采用自组装肽（SAP）和神经前体细胞（NPC）联合生长因子治疗颈段脊髓损伤，是一种促进神经再生与功能恢复的有前景的策略。本研究建立了颈段脊髓损伤的 contusion/compression 动脉瘤夹大鼠模型，并采用 SAP 注射联合 NPC...

神经前体细胞与自组装肽在实验性颈段脊髓损伤中的协同应用

脊髓损伤是一种导致严重发病率和高死亡率的创伤性疾病。在本研究中，我们详细描述了一种小鼠脊髓损伤的挫伤模型，随后进行神经干细胞移植。...

脊髓损伤实验性挫伤模型中的神经干细胞移植

严重的脊髓损伤常导致组织缺损。本文描述了两种成功桥接此类缺损的方法，可通过在急性损伤后以及完全脊髓横断五周后植入机械微连接系统，促进大鼠的组织适应、再生反应及功能改善。...

急性与慢性损伤后修复脊髓大范围组织缺损的实验策略

本文介绍了一种技术：在脊髓完全横断后，将一个中空导管插入脊髓残端之间，并填充施万细胞（SCs）和可注射的基底膜基质，以桥接断端并促进轴突跨越缺损区域再生。...

将雪旺细胞移植至聚偏氟乙烯-三氟乙烯导管内以桥接大鼠横断脊髓残端促进轴突再生跨越缺损

本文中，我们提供了一种可重复的方法，用于生成并长期维持移植了神经干细胞的脊髓组织切片 离体 用于测试细胞替代疗法的模型。...

长期小鼠脊髓器官型切片培养作为验证脊髓损伤后细胞移植的平台

本研究开发并表征了可模拟神经功能的复合水凝胶，可用于研究并利用脂肪来源干细胞在脊髓损伤修复中的促再生行为。...

利用干细胞递送开发脊髓损伤的联合治疗策略

本实验方案描述了一种通过将肿瘤细胞注射至椎间空间来建立可重复的小鼠脊髓胶质瘤模型的方法，为研究和治疗开发提供了一种更有效且侵入性更小的途径。...

小鼠脊髓内肿瘤细胞的手术移植

学习神经前体细胞移植技术，用于脊髓损伤和肌萎缩性脊髓侧索硬化症研究。该方法通过椎板切除术将细胞精准注入颈段脊髓腹角，保护膈运动神经元功能。

脊髓内细胞移植用于靶向治疗肌萎缩侧索硬化症和创伤性脊髓损伤中的颈段腹角

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