Name: IgY的技术:从蛋黄鸡抗体提取聚乙二醇（PEG）降水量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解使用聚乙二醇沉淀法从鸡蛋黄中提取IgY抗体的完整实验流程。该方法操作简便、成本低廉，适用于免疫学研究中高效获取高活性抗体。

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本工作由德国联邦教育与研究部资助（项目 BiGRUDI［生物危险情景：风险评估、超快速检测与鉴定生物恐怖相关制剂，13N9594］）。我们感谢柏林夏里特医学院药理学研究所 B. Diemar 提供的出色技术支持。

1. 实验方案——通过聚乙二醇沉淀法提取IgY
图1展示了IgY提取流程的示意图（见表2）。该方案最初由Polson et al. 于1980年描述。 
所有步骤均应佩戴乳胶手套操作。
<ol>
 <li>小心敲碎蛋壳，将蛋黄转移至“蛋黄勺”中，以尽可能去除蛋清。</li>
 <li>将蛋黄转移至滤纸上并滚动，以去除残留的蛋清，然后用采血针或类似工具（如移液器吸头）切开蛋黄膜。将蛋黄倒入50 ml离心管中，并记录蛋液体积（V1）。</li>
 <li>加入两倍于蛋黄体积的PBS与蛋黄混合（总体积为V1+V2），然后按总体积加入3.5%的PEG 6000（以克计，粉末状），涡旋混匀，随后在滚轴混合器上滚动10分钟。该提取步骤使混合物分离为两相：一相为“蛋黄固体和脂类物质”（引自Polson等，1980年的原始描述），另一相为含有IgY及其他蛋白质的水相。</li>
 <li>将离心管在4°C下以10,000 rpm（相当于13,000 × g，Heraeus Multifuge 3SR+，固定角转子）离心20分钟。将上清液（V3）通过折叠滤纸过滤后转移至新离心管中。</li>
 <li>根据新体积计算，向管中加入8.5%的PEG 6000（以克计），涡旋混匀，并参照步骤3在滚轴混合器上滚动混匀。</li>
 <li>重复步骤4，但此次弃去上清液。</li>
 <li>用玻璃棒和涡旋振荡器小心将沉淀溶解于1 ml PBS中，再加入PBS至终体积为10 ml（V4）。向该溶液中加入12% PEG 6000（w/v，1.2克），并按步骤3的方法处理（涡旋、滚轴混合）。</li>
 <li>重复步骤6，小心将沉淀溶解于800 μl PBS中（使用玻璃棒和涡旋振荡器）。待气泡完全消失后，用移液器将提取液转移至透析袋中。用400 μl PBS冲洗离心管，并将冲洗液一并加入透析装置中（V5）。（透析装置及膜的准备方法见附录。）</li>
 <li>将提取液在0.1%生理盐水（1,600 ml）中透析过夜，并使用磁力搅拌器轻轻搅拌。次日清晨更换为PBS，继续透析三小时。</li>
 <li>随后用移液器将IgY提取液从透析袋中取出，转移至2 ml离心管中。最终体积约为2 ml（V6）。</li>
 <li>将样品用PBS稀释50倍后，在280 nm处进行分光光度法测定蛋白质含量（mg/mL），并根据Lambert-Beer定律及IgY的消光系数1.33进行计算（见图2）。图4展示了制备样品的质量（纯度和回收率均约为80%）。</li>
 <li>建议将样品分装后于-20°C保存（避免在-70°C下冷冻样品）。</li>
 <li>最终制备物的质量可通过JoVE实验方案中描述的简单SDS-PAGE进行分析，详见 <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a></li>
</ol>
 2. 附录——使用透析袋前，必须按照生产商的建议以以下方式准备：
<ol>
 <li>
将20根透析袋剪成30 cm长的小段，放入2000 ml的玻璃烧杯中。
 </li>
 <li>
加入1,750 ml的5 mM EDTA溶液。
 </li>
 <li>
在透析袋上方放置一个玻璃漏斗，确保透析袋完全浸没于EDTA溶液中。将溶液加热并煮沸5分钟（使用电热板）。倾去溶液，透析袋用蒸馏水清洗三次。
 </li>
 <li>
再次加入1,750 ml EDTA溶液，煮沸5分钟，然后如上所述用蒸馏水清洗三次。
 </li>
 <li>
最后将透析袋在蒸馏水中煮沸10分钟，并于4°C下保存。使用无菌镊子取出透析袋。
 </li>
 </ol>

3. 代表性结果

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="聚乙二醇（PEG）沉淀示意图；从蛋黄中分离免疫球蛋白的方法。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 根据 Polson et al. 1980 年原始描述，采用聚乙二醇沉淀法提取 IgY 的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">单击此处查看大图。</a>

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="IgY 水平与免疫后周数的关系；显示鸡体内蛋白质随时间变化的折线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 免疫母鸡蛋黄中总 IgY 随年龄变化的发育情况。数据表示每周每枚蛋中总 IgY 的平均值及标准差（SD，n = 4 只产蛋母鸡）。来源：[Pauly et al. 2009]。

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="免疫后母鸡产蛋能力曲线图；纵向数据，每周产蛋数量，折线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
 图 3. 
 四只接种不同抗原的母鸡的产蛋能力监测。箭头表示免疫接种日期（引自 [Pauly et al. 
 2009]）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">点击查看高清图像。</a>

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="SDS-PAGE 电泳结果，按分子量分离蛋白质，泳道标注为 HC、LC。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
 图 4. 不同鸡蛋来源的单个 IgY 制品在还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 
 泳道 1 - 分子量标记物，泳道 2 - IgY 标准品，泳道 3-5 - 按本方案所述方法制备的不同 IgY 样品。这些样品为按照方案第 10 步所得的最终制品。
 HC - 重链，LC - 冲链，? - 分子量约为 35 kDa 的少量杂质（可能为卵黄原蛋白 II 前体的 C 末端片段，[Klimentzou et al., 2006]）。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td>鸡 21 (抗原 A)</td>
 <td>鸡 22 (抗原 A)</td>
 <td>鸡 19 (抗原 B)</td>
 <td>鸡 23 (抗原 C)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>产蛋数（总 IgY）1，2 年期间</td>
 <td>625（38 g）</td>
 <td>626（38 g）</td>
 <td>545（33 g）</td>
 <td>608（37 g）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>产蛋数（总 IgY），第一年</td>
 <td>345（20 g）</td>
 <td>304（16 g）</td>
 <td>326（18 g）</td>
 <td>308（17 g）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>产蛋数（总 IgY），第二年</td>
 <td>280（18 g）</td>
 <td>322（21 g）</td>
 <td>219（15 g）</td>
 <td>300（20 g）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第一年最高可能产蛋数的百分比2</td>
 <td>106</td>
 <td>93</td>
 <td>100</td>
 <td>95</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>第二年最高可能产蛋数的百分比</td>
 <td>86</td>
 <td>99</td>
 <td>67</td>
 <td>92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>已处理的鸡蛋数量</td>
 <td>565</td>
 <td>620</td>
 <td>283</td>
 <td>401</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

1总IgY的量通过将鸡蛋数量乘以每枚鸡蛋平均60 mg蛋白质来计算，依据图2的数据。



 2根据饲养者提供的信息，每年最多可能产卵 325 枚。


表1. 免疫不同抗原的鸡产蛋能力的两年统计数据。免疫不同抗原后四只母鸡最大产蛋能力的百分比，以及两年期间的IgY产量（另见图3）[Pauly et al. 2009]。
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>卵编号</td>
 <td>产蛋母鸡编号 产蛋日期</td>
 <td>V1[ml] 卵黄体积</td>
 <td>V2[ml] PBS 体积</td>
 <td>第一次 PEG 沉淀 [g]</td>
 <td>沉淀、离心和过滤后的体积 [ml]</td>
 <td>第二次 PEG 沉淀 [g]</td>
 <td>沉淀物</td>
 <td>第三次 PEG 沉淀 [g]</td>
 <td>沉淀物</td>
 <td>透析后体积 [ml]</td>
 <td>总蛋白浓度 mg/ml</td>
 <td>校正后总蛋白浓度 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>2×V1，∑V1 + V2</td>
 <td>3.5% [w/v]，∑V1 + V2</td>
 <td>沉淀、离心和过滤后体积 V3</td>
 <td>8.5% [w/v] V3</td>
 <td>溶解于 V4 ml PBS 中</td>
 <td>12% [w/v] V4</td>
 <td>溶解于 V5 ml PBS 中</td>
 <td>对 PBS 透析后体积 V6</td>
 <td>A280/ml</td>
 <td>A280/ml ÷ 1.33</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>H293 / 22.10.</td>
 <td>15</td>
 <td>30 45</td>
 <td>1.58</td>
 <td>31</td>
 <td>2.63</td>
 <td>10</td>
 <td>1.2</td>
 <td>1.2</td>
 <td>1.7</td>
 <td>35.0</td>
 <td>26.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2</td>
 <td>H293 / 23.10.</td>
 <td>13</td>
 <td>26 39</td>
 <td>1.37</td>
 <td>25</td>
 <td>2.12</td>
 <td>10</td>
 <td>1.2</td>
 <td>1.2</td>
 <td>1.7</td>
 <td>28.8</td>
 <td>21.6</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. PEG 沉淀的示例性实验方案

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

动物实验严格按照柏林卫生与社会事务局（Landesamt fur Gesundheit und Soziales Berlin，H 0069/03）制定的指南和规定进行。

选择合适的IgY纯化方法受纯化规模（实验室或工业级）、成本效益、技术条件（实验室设备）以及对环境的影响（废物管理）等因素影响。De Meulenaer与Huyghebaert（2001年）以及Schade 等（2005年）已对多种IgY提取方法进行了详细综述。总体而言，这些方法可分为三大主要类别：

<ol> 
 <li>
 沉淀法：包括硫酸铵或硫酸钠沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法、辛酸沉淀法以及卡拉胶沉淀法。
 </li>
 <li>
 层析方法：亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、硫亲和相互作用层析以及凝胶过滤层析。
 </li>
 <li>
 超滤法。
 </li>
</ol> 
通过结合多种方法可提高IgY制备物的纯度；例如，可将聚乙二醇（PEG）沉淀法与亲和层析法联合使用。在某些情况下，根据最终应用目的，仅使用IgY的水提取物即可获得良好效果（Akita &amp; Nakai 1993）。根据我们的经验，通过PEG沉淀法获得的IgY样品在多种不同的免疫学检测中表现非常理想。通过标准化PEG沉淀方法，一名技术助理每周可处理约84枚鸡蛋，相当于每周获得4至7克总IgY。简单计算如下：一只产蛋母鸡经抗原免疫后，经过数次加强免疫，在30天内可产生效价达1:50,000的特异性抗体（Ab）。30枚鸡蛋 × 每枚2 ml IgY提取物（见实验方案及图3），共得60 ml总IgY，相当于抗体稀释体积达3,000升（一个水桶的容量为10升），即可用该抗体溶液填满300个水桶。因此，考虑到如此巨大的抗体产量，储存具有恒定质量和特异性的抗体库并非难事。该技术可减少多特异性抗体中常见的批次间差异。

 除了数量方面的优势外，IgY 抗体相较于哺乳动物 IgG 还具有其他优点：不会激活哺乳动物补体系统，不与人抗鼠抗体（HAMA）、类风湿因子或人类血型抗原发生交叉反应（缺乏异种凝集素）。


IgY-Ab 的一个显著优势是所谓的系统发育距离。这种系统发育距离导致了即使在相同免疫条件下，哺乳动物与鸡所产生的抗体特异性常常存在显著差异。除了哺乳动物与鸟类免疫系统本身的差异外，这两大类动物在系统发育上的差异也促成了抗体特异性的不同。已有多个研究者报道，鸡在针对系统发育上高度保守的哺乳动物蛋白或多肽产生抗体时，其效率通常高于兔子（综述见 Schade 等，2005）。因此，某些保守的抗原在兔子免疫系统中可能保持“隐蔽”状态，从而仅引发微弱或“沉默”的免疫应答。此外，当鸡和兔子被同一哺乳动物抗原免疫时，鸡往往会产生在兔子中极难获得的抗体特异性。动物福利方面同样重要，因为抗体可非侵入性地从蛋黄中提取。结合基因枪（质粒）免疫技术，IgY 的生产可实现完全非侵入性（Witkowski et al. 2009）。
 
 
综上所述，利用母鸡生产抗体并通过聚乙二醇（PEG）沉淀法提取IgY，是一种非常经济高效的方法，可获得效价稳定且特异性很高的抗体，其效价可达1:1,000,000。由于鸟类（Aves）与哺乳类（Mammalia）之间存在较远的系统发育距离，鸡能够针对高度保守的哺乳动物抗原产生特异性抗体，而例如兔则往往难以做到这一点。通过IgY技术所获得的大量抗体，为IgY抗体在人类医学和兽医学中用于治疗或预防目的开辟了广阔的应用前景。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt;&lt;李&gt;透析袋 Visking，型号 27/32，截留分子量 14 kD，Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄&lt;/li&gt;&lt;李&gt;Falcon 离心管 Blue Max，50 ml 聚丙烯锥形管，Becton Dickinson Labware，Franklin Lakes NY，美国 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;折叠滤膜 MN 615 &amp;#188;，150 mm，Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄 Heraeus &lt;/li&gt;&lt;李&gt;磁力搅拌器，Variomag Mono，H+P Labortechnik AG，Oberschlei&amp;#223;德国海姆 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;Micro-Dialyse-Capsule 5.0 ml，Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;Multifuge 3SR+，Thermo Scientific，德国兰根塞尔博德 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;分光光度计 UV-160A，Shimadzu Deutschland GmbH，德国杜伊斯堡 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;聚乙二醇 6000，Rotipuran Ph. Eur.，Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;预混PBS缓冲液10倍浓缩液，Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆 &lt;/li&gt;&lt;李&gt; Roller Mixer SRT2，Stuart，英国斯塔福德郡 &lt;/li&gt;&lt;李&gt; Vibrofix VF2，Janke &amp;amp; Kunkel，IKA-Labortechnik，Staufen i.Br.，德国 &lt;/li&gt;&lt;李&gt;蛋黄分离器，Fackelmann（家用器具），德国 &lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

igy 技术：通过聚乙二醇（peg）沉淀法从鸡蛋蛋黄中提取鸡源抗体

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

可通过肌肉注射免疫母鸡（左右侧Musculus pectoralis，注射体积为0.5–1.0 ml），或采用基因枪质粒免疫法进行免疫。根据抗原的免疫原性，仅需一次或3–4次加强免疫，即可获得高滴度抗体（可达1:100,000–1:1,000,000）。通常情况下，一只母鸡可持续产蛋约72周，之后产蛋能力逐渐下降。本方案描述了通过沉淀法（PEG，Polson et al. 1980）从蛋黄中提取总IgY的方法。该方法包含两个关键步骤：第一步是去除脂质，第二步是从第一步所得上清液中沉淀总IgY。将提取的IgY在缓冲液（通常为PBS）中透析后，可在-20°C下保存一年以上。提取物的纯度约为80%，每枚鸡蛋中总IgY含量为40–80 mg，具体数值取决于产蛋母鸡的年龄。随着母鸡年龄增长，每枚蛋中总IgY含量从约40 mg逐渐增加至80 mg（以PEG沉淀法为准）。一只母鸡每年产蛋量约为325枚，这意味着基于平均每枚蛋含60 mg总IgY计算，每年可获得约20 g总IgY的潜在收获量（见表1）。

本方案特别描述了通过聚乙二醇沉淀法从蛋黄中提取总IgY的方法，并提供了有关IgY技术的一般信息。

IgY 技术：通过聚乙二醇（PEG）沉淀法从鸡蛋蛋黄中提取鸡源抗体

可通过肌肉注射（胸肌，左右侧，注射体积0.5–1.0 ml）或基因枪法对母鸡进行免疫。

本视频将展示从母鸡中分离IGY抗体的过程，母鸡可通过基因枪法、质粒转染，或更传统的肌肉注射方法进行免疫。首先，分离蛋黄；然后沉淀其中的脂质，接着沉淀含有抗体的蛋白质组分，并通过进一步的沉淀步骤纯化获得抗体。最后，将抗体对 PBS 进行透析。是的。您好，我叫 Ard。这是我的同事 Adema，我们在柏林沙大学医学部历史悠久且著名的药理学研究所工作。接下来，我们将向您展示从鸡蛋、酸奶中提取IGY的方法，这是一种非常简单且成本效益极高的技术。这些方法总体上属于所谓的IGY技术。IGY制备的第一步是分离蛋黄。进行此操作时，我们需要试管架、蓝色瓶盖、滤纸、移液器吸头缓冲液、玻璃烧杯，以及用于分离蛋黄和蛋清的蛋黄勺，当然还有鸡蛋。将鸡蛋在蛋黄勺上方打碎，以使蛋清流出。然后轻轻晃动盛有蛋黄的蛋黄勺，以去除大部分蛋清。随后将蛋黄转移至滤纸上，以尽可能完全地去除蛋清蛋白。蛋壳在储存不超过一个月的鸡蛋中非常稳定，但储存超过三个月后则不然。在滤纸上滚动过程中，蛋黄膜可能因老化过程而破裂。随后，用移液器吸头打开卵黄膜，并将其转移至离心管中。最后可见卵黄体积约为15毫升。该体积在成年产蛋母鸡中属于正常范围，个体间差异极小。记录卵黄体积。使用3.5%聚乙二醇作为沉淀剂，在PBS缓冲液中分离卵黄中的脂质和包括IGY在内的卵黄蛋白。根据最终卵黄与缓冲液体积的3.5%，称取1.58克聚乙二醇。将15毫升卵黄与两倍体积的PBS缓冲液混合，即加入30毫升PBS，最终总体积为45毫升。然后将聚乙二醇加入该混合液中。将试管盖紧，然后涡旋振荡20至30秒。在涡旋过程中，定期倒置试管。涡旋振荡后，卵黄应完全悬浮。将试管置于滚轴混合器上混合10分钟。最终得到均匀的混合物，颜色由黄色变为浅黄色。现在将混合物离心20分钟。离心后可分离出含有IgY及其他蛋白质的澄清上清液，以及主要由脂质组成的黄色沉淀。下一步，将上清液通过折叠滤纸过滤，并转移至新试管中。记录新的体积并弃去沉淀。现在，再次向 supernatant 中加入聚乙二醇，使其终浓度达到 12%。这意味着第一次沉淀中加入 3.5%，再加上所得 SNAT 体积的 8.5%，合计为 12%。随后，将溶液如前所述在滚轴混合器上搅拌孵育，并离心 20 分钟。此时，聚乙二醇会沉淀出 IGY 及其他蛋白质。经过此离心步骤后，沉淀将用于后续溶解的准备。使用70%乙醇对沉淀玻璃棒进行消毒，同时让玻璃棒自然晾干，弃去S上清液。然后将离心管倒置，以沥干残留的上清液。向沉淀中加入1毫升PBS。使用玻璃棒在充分涡旋的同时溶解沉淀。此时可见略带黄色的溶液。现在加入 PBS 至终体积为 10 毫升，随后进行第三次聚乙二醇沉淀，浓度为 12%，操作与前一次相同，但不同于第二次离心步骤。此次离心 20 分钟后获得白色沉淀。沉淀物的溶解方式与之前相同，但分两步进行。第一步，将其溶解于 0.8 毫升 PBS 中，并转移至微透析胶囊内。然后用额外的 0.4 毫升 PBS 冲洗离心管，冲洗液也一并转移至胶囊中。下一步，用消毒过的剪刀剪开透析袋，并用蒸馏水冲洗。将透析袋置于胶囊的下部，并用上部紧密封合。最后，将胶囊转移至放置在磁力搅拌器上的玻璃烧杯中，igy溶液用0.1%生理盐水透析过夜。第二天，将IGY溶液在PBS中透析3小时。透析结束后，用移液器枪头刺破透析膜，取出IGY溶液并转移至小管中。记录最终体积。最终产物为澄清溶液，可在零下20摄氏度保存数年。根据我们的经验，切勿将IGY制备物保存在零下70摄氏度，因为我们观察到在此温度下活性显著下降。好了，希望我们能够使您确信，按照我们的方案从a中提取IDY确实是一种非常简单且高效的流程。所需的设备极少，我们认为投入与收益之间具有良好的比例。我希望本视频出版物能鼓励您充分利用我们的方案和技术，我也会如此。谢谢。

igy-technology-extraction-chicken-antibodies-from-egg-yolk

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

IgY的技术：从蛋黄鸡抗体提取聚乙二醇（PEG）降水量

在本视频中，我们演示了从肽段混合物中使用抗体进行磷酸化肽段的免疫沉淀。富集后的磷酸化肽段经真空浓缩并保存，用于后续分析。...

磷酸化肽富集：一种基于抗体的免疫沉淀技术，用于从复杂的肽混合物中分离特异性的磷酸化肽

本视频演示了一种从中国仓鼠卵巢细胞收获的细胞培养液中纯化单克隆抗体的实验方法。该方法采用固定化蛋白A的多孔玻璃树脂，蛋白A可特异性结合样品中抗体的Fc区，从而有效将其与杂质分离。通过低pH洗脱缓冲液减弱蛋白A与抗体之间的相互作用，进而实现纯化抗体的回收。...

一种纯化中国仓鼠卵巢细胞产生的单克隆抗体的技术

为了理解特定基因组功能区域的调控机制，需要鉴定与这些区域相关的分子。本实验方案描述了利用人工设计的DNA结合分子介导的染色质免疫沉淀（enChIP）技术，来鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和RNA的操作步骤。...

通过enChIP技术分离特定基因组区域及鉴定其相关分子

雷诺丁受体的寡聚化，一种介导Ca²⁺释放的同源四聚体离子通道2+ 来自细胞内储存的释放，对骨骼肌和心肌收缩至关重要。本文中，我们介绍互补的 体内 和 体外...

遗传学与生物化学方法 体内 和 体外 蛋白质寡聚化的评估：以兰尼碱受体为例

串联亲和纯化（TAP）方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核细胞）中分离天然复合物，以进行蛋白质组学研究。本文介绍了一种经过优化的TAP方法实验方案，适用于为结构研究纯化天然复合物。...

使用串联亲和标签法纯化用于结构研究的天然复合物

该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus...

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

本文报道了一种简单的方法，可在尽量减少结构改变的前提下分离鸡蛋的外层和内层卵周质亚层，并优化各亚层蛋白质的溶解性，以用于蛋白质组学分析。...

机械分离与溶解鸡卵外层和内层卵周质亚层中的蛋白质

抗体的糖基化模式决定了其临床表现，因此工业界和学术界一直在努力控制糖基化过程。由于典型的糖基工程实验耗时且劳动密集，建立一种通过瞬时沉默技术快速表征糖基化相关基因影响的实验方案将具有重要意义。...

中国仓鼠卵巢细胞中快速抗体糖工程改造

本方案描述了一种用于制备乳胶微球的方法，该微球可用于基于IgY抗体的抗原检测实验。...

基于卵黄抗体的流式微球阵列检测标准化

蛋白质-蛋白质相互作用对于阐明靶蛋白的功能至关重要，而免疫共沉淀（co-IP）可轻松验证蛋白质相互作用（PPI）。我们将编码表位标签蛋白的质粒瞬时转染至HEK-293细胞中，并建立了一种免疫沉淀方法，以简便地验证两种靶蛋白之间的结合。...

使用抗表位标签亲和凝胶进行免疫沉淀以研究蛋白质-蛋白质相互作用

了解使用聚乙二醇沉淀法从鸡蛋黄中提取IgY抗体的完整实验流程。该方法操作简便、成本低廉，适用于免疫学研究中高效获取高活性抗体。

IgY 技术：通过聚乙二醇（PEG）沉淀法从鸡蛋蛋黄中提取鸡源抗体

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