哺乳动物细胞中重组抗体的制备与纯化

从一个含有重链和轻链抗体基因的独立载体的试管开始。

加入转染试剂以与载体形成复合物。

将该混合物转移至哺乳动物宿主细胞中，并孵育以促进内化。

添加抗聚集剂以促进转染细胞的均匀分布，提高细胞回收率和生长效果。

加入抗菌-抗真菌溶液以防止污染。

在宿主细胞内，载体整合到宿主基因组中。

基因转录完成后，单个mRNA离开细胞核并进行翻译，形成新生的抗体链。

新生链的正确折叠和修饰产生重链和轻链。

这些链组合形成完全功能性的抗体，随后被释放到细胞外介质中。

收集培养基并离心，过滤上清液。

将滤液通过纯化柱，使抗体选择性结合。

使用洗脱缓冲液洗脱纯化的抗体。

将CHO细胞在200毫升培养基中接种于长型带挡板的锥形瓶中进行培养。在15毫升离心管中，加入5毫升CHO FreeStyle培养基、50微克的可变重链克隆DNA以及75微克的可变轻链克隆DNA。随后，涡旋混匀该管。室温下静置5分钟。向DNA溶液中加入750微升浓度为1毫克/毫升的聚乙烯亚胺储备液，并剧烈涡旋30秒。

将混合物在室温下继续放置5分钟。在手动摇动烧瓶的同时，将全部混合物加入CHO细胞中。立即在37摄氏度、130转/分钟的摇床中孵育细胞。

次日，向细胞中加入 2 毫升 100 倍防结块剂和 2 毫升 100 倍抗菌抗真菌溶液。将培养瓶在 32 至 34 摄氏度、130 转/分钟振荡条件下培养。继续培养细胞 10 至 11 天，每隔 5 天添加 10 毫升胰蛋白胨 N1 培养液和 2 毫升 100 倍谷氨酰胺补充液。每隔 3 天进行一次细胞计数，确保细胞活力保持在 80% 以上。在第 10 或第 11 天，通过在 3,000 × g、4 摄氏度条件下离心 40 至 60 分钟收集培养基用于抗体纯化。随后，使用 0.22 微米瓶式滤器过滤上清液。

为纯化抗体，先用两倍柱体积的结合缓冲液平衡蛋白A柱。以每分钟1毫升的流速将过滤后的培养基通过色谱柱。随后用两倍柱体积的结合缓冲液洗涤色谱柱。使用5毫升洗脱缓冲液将抗体洗脱至每管500微升的组分中。