一种用于制备抗金属肽酶单克隆抗体的杂交瘤技术

取一只经金属肽酶免疫的小鼠，摘除脾脏并制备单细胞悬液。

通过滤网过滤悬浮液，并离心以去除组织碎片。

分离的细胞包括金属蛋白酶特异性的B细胞，可产生针对金属蛋白酶表位的抗体。

加入缺乏HGPRT酶的永生化骨髓瘤细胞，阻止核苷碱基在核苷酸合成中的再利用。这些细胞得以存活 通过 从头核苷酸合成

离心以获得沉淀，并弃去上清液。

加入PEG并孵育，诱导骨髓瘤细胞与B细胞融合，形成HGPRT阳性永生杂交瘤细胞。

加入含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的HAT培养基。转移至含有腹腔巨噬细胞饲养层的孔中，以促进杂交瘤细胞的生长。

氨基蝶呤阻断核苷酸的从头合成，导致未融合的骨髓瘤细胞死亡。未融合的B细胞因其寿命较短而死亡。

HGPRT 阳性的杂交瘤细胞可利用核苷酸前体次黄嘌呤和胸苷进行补救合成，进而增殖并分泌金属肽酶特异性的单克隆抗体。

收集上清液以确认抗体的产生 通过 下游实验

首先，对选定的成年雌性小鼠进行腹腔注射，每只注射100微克APM蛋白，以进行最终的抗原加强。注射后3天，采集小鼠的脾脏，并用DMEM洗涤两次，以去除血液和脂肪细胞。

使用200目铜网过滤脾细胞悬液以去除组织碎片，并通过离心收集脾细胞以去除脾膜。将小鼠SP2/0骨髓瘤细胞接种于含有5毫升DMEM（补充6%胎牛血清）的25平方厘米培养瓶中，并在37°C、6%二氧化碳气氛中培养以维持细胞活力。

培养5至6天后，细胞复苏后的融合度应达到80%至90%，在显微镜下呈圆形、明亮且清晰。杂交前一天，从小鼠的腹腔收集巨噬细胞。

以每毫升0.1至0.2乘以10的5次方的密度，将腹腔巨噬细胞接种于96孔板中，每孔加入含100 µL HAT培养基的细胞悬液，过夜培养。用于融合时，用移液器轻轻吹打8至10瓶SP2/0细胞，收集后重悬于10 mL无血清DMEM培养基中。

用新鲜的DMEM洗涤细胞，离心两次，然后重悬于10毫升DMEM中。将定量的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例混合，转移至50毫升离心管中。

离心后，弃去上清液，收集试管底部的沉淀。在杂交前轻弹试管以松动沉淀。使用滴管，在45秒内将1毫升预先加热至37摄氏度的聚乙二醇1,500逐滴加入松散的细胞沉淀中，同时轻轻旋转试管底部。

然后，在90秒内缓慢向混合物中加入1毫升预热至37°C的DMEM，接着加入30毫升新鲜DMEM，并将融合管置于37°C水浴中孵育30分钟。

孵育结束后，收集细胞。用HAT培养基重悬细胞，并接种于96孔板中，每孔含有腹腔巨噬细胞。5天后，向每孔加入100微升新鲜HAT培养基。再次孵育5天后，将培养基更换为HT培养基。使用包被了APN蛋白的微孔板进行ELISA检测，其中APN蛋白用0.05摩尔PBS稀释至5微克/毫升，用于分析杂交瘤上清中的单克隆抗体。