一种针对金属肽酶产生重组抗体的方法

取一支含有阳离子脂质转染试剂的离心管，加入重组表达质粒。

该质粒在一个启动子下携带编码金属肽酶靶向重组抗体和绿色荧光蛋白（GFP）的基因，而抗生素抗性基因则位于另一个启动子下。

带正电荷的脂质与带负电荷的质粒相互作用，形成复合物。

将复合物转移至含有哺乳动物细胞的多孔板中，使质粒进入细胞质。

质粒进入细胞核后，转录出编码抗生素抗性蛋白的mRNA，以及编码重组抗体和GFP的双顺反子mRNA。

这些mRNA可导致重组抗体、绿色荧光蛋白（GFPs）和抗生素抗性蛋白的产生。

转染后，将培养基更换为含血清的培养基。

加入抗生素，选择性地清除未转染的细胞，而具有抗生素抗性的转染细胞则存活下来。

利用荧光激活细胞分选技术，收集表达重组抗体的绿色荧光细胞。

将稀释后的转染细胞接种于无血清培养基中，并孵育以产生针对金属肽酶的重组抗体。

在37摄氏度下，于含有0.4毫摩尔β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷的培养基中，将pET-28a(+)重组抗体氨肽酶在BL21转化细菌中于摇床中培养10小时。将100微升含0.5 × 10⁵个中国仓鼠卵巢细胞的悬液接种至96孔板中，每孔接种量为100微升，在37摄氏度、6%二氧化碳气氛中孵育18至24小时。

当细胞融合度达到80%至90%时，用Opti-MEM将质粒中的pIRES2-ZsGreen1重组抗体氨肽酶稀释至终浓度为0.1微克每微升。5分钟后，将50微升稀释后的pIRES2-ZsGreen1重组抗体氨肽酶质粒与1微升Lipofectamine 2000和49微升Opti-MEM混合。

孵育20分钟后，将100 µL混合物加入含有CHO细胞的96孔板的每个孔中。转染后4至6小时，更换为添加了10% FBS的DMEM/F12培养基。

孵育48小时后，向每孔加入400微克/毫升G418，以筛选稳定转染的细胞。使用添加了10%胎牛血清和400微克/毫升G418的DMEM/F12培养基进行10天筛选后，采用荧光激活细胞分选技术对细胞进行分选。将收获的阳性细胞进行连续稀释，以平均每孔0.5至2个细胞的密度接种于96孔板中，并在37°C、6%二氧化碳培养箱中培养。