利用海马神经元培养检测人血清中自身抗体的实验方法

取大鼠胚胎海马组织。

加入胰蛋白酶。孵育以介导组织基质降解，使海马细胞松散。

用缓冲液稀释。继续孵育以进行胰蛋白酶的酶消化。

接下来，将组织块转移至含有培养基的离心管中。反复吹打以进行机械解离，获得单细胞悬液。

将种子细胞接种于培养板内经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上。

孵育。海马神经元会贴附于包被的表面，神经元将形成前缘并延伸出次要神经突。

此外，神经突以轴突和树突过程生长，形成神经元网络。

成熟的神经元表达突触兴奋性受体，即N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）。

孵育后，用培养基洗涤盖玻片。

加入稀释的自身免疫性脑炎患者血清。自身抗体与神经元NMDAR结合。

用缓冲液洗涤细胞，然后固定。

加入可结合至NMDAR结合的自身抗体上的荧光标记二抗。

用缓冲液洗涤。将盖玻片置于含DAPI的封片剂上以染色细胞核。

在显微镜下观察神经元上的荧光信号，以指示血清中存在自身抗体。

将含有海马体的50毫升离心管中的体积用HBSS调整至5毫升，并加入1毫升2.5%胰蛋白酶，用于海马体的酶解。随后将离心管置于37摄氏度水浴中孵育15分钟。为进一步稀释胰蛋白酶，加入10毫升预热的HBSS，并将离心管重新放回设定为37摄氏度的水浴中继续孵育5分钟。

接下来，使用1,000微升移液器将呈现为黏性团块的海马体转移至一个50毫升离心管中，并加入6毫升预热的HBSS，孵育5分钟，操作如图所示。为进行机械解离，将海马组织团块转移至一个带有锥形底部的2毫升离心管中。加入1毫升预热的DMEM培养基后，使用1,000微升移液器轻轻反复吹打，使组织沉淀充分匀浆。

使用预先拉制的玻璃移液管，将管尖接触试管的锥形底部，上下吸取10至20次，注意避免产生气泡，直至混合液呈半透明状。在用交叉振荡动作将细胞均匀分配到3.5厘米培养皿之前，先对细胞进行计数。操作完成后，将培养皿放入含5%二氧化碳的培养箱中。

14天荧光免疫染色 体外 细胞，将含有抗NMDAR抗体的样本加入盖玻片中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。一小时后，用含4%多聚甲醛的PBS溶液在室温下固定5分钟。随后用PBS洗涤样本三次，每次5分钟，接着加入1:1,000稀释的二抗——山羊抗人Alexa Fluor 488，在室温下孵育1小时。然后用液体封片剂封固含有样本的盖玻片，并吸去多余液体。