一种用于测定呼吸道合胞病毒特异性中和抗体滴度的检测方法

取连续稀释的、经热灭活的含呼吸道合胞病毒（RSV）特异性中和抗体的人血清。

加入病毒悬液。抗体以浓度依赖性方式中和病毒。

将混合物加入人上皮细胞单层中，并孵育以进行病毒吸附。

弃去混合液，加入含羧甲基纤维素的培养基，形成半固体覆盖层，孵育。

呼吸道合胞病毒利用宿主细胞的机制合成病毒RNA和蛋白质，随后组装并以单个病毒粒子的形式出芽释放。

受感染的细胞最终会死亡。羧甲基纤维素可限制病毒的移动，导致局部感染和细胞死亡，从而形成空斑。

移除覆盖层。

使用含丙酮的缓冲液固定细胞。加入含去污剂的封闭缓冲液，以通透细胞并防止非特异性抗体结合。

加入靶向病毒蛋白的一抗。

使用针对一抗的荧光染料标记的二抗进行孵育。

对孔板进行成像以定量荧光斑块。

血清最高稀释度能够中和50%的呼吸道合胞病毒（RSV），该稀释度即为中和滴度。

在用呼吸道合胞病毒（RSV）接种A549细胞之前，需在光学显微镜下检查细胞培养板，确认A549细胞单层达到80%融合度。随后轻轻倒置培养板以弃去培养基，并将培养板轻压于无菌吸水纸巾上稍作吸干。每次使用过滤除菌的PBS洗涤后均需进行此操作。

接下来，根据文稿中提供的孔板模板，将每孔100微升的病毒-血清混合物加入A549细胞板的相应孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，使用移液器将每孔中的90微升液体吸出，然后每孔加入100微升含有1X M-199、1.5% CMC、2% FCS和青霉素-链霉素混合物的培养基。将孔板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育三天。

固定和制备检测板时，首先轻轻倒置感染 RSV 的 A549 细胞板，弃去含有 M 199、CMC、2% FCS 和青霉素-链霉素混合液的培养基。然后，每孔缓慢加入 200 微升固定缓冲液。将板在 -20 摄氏度孵育 20 分钟。随后弃去固定缓冲液，并在吸水纸巾上轻轻拍干。

将板倒置静置干燥10分钟。然后，用含有0.05吐温-20的过滤PBS缓冲液配制5%脱脂奶粉封闭液。每孔加入200微升封闭液，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，轻轻倒置酶标板以弃去溶液，并在吸水纸上轻拍去除残留液体。

制备一抗时，将羊抗 RSV 抗体用封闭液按 1:500 稀释。每孔加入 50 µL，37 °C 孵育 1 小时。用过滤后的 PBS 吐温溶液洗涤平板 3 次。

接下来，将AlexaFluor驴抗山羊IgG以1:5,000的比例用封闭液稀释，配制二抗。每孔加入50 µL，37 °C孵育1小时。用过滤后的PBS吐温溶液洗涤5次。

使用自动斑点计数仪计数斑块时，首先使用一个未使用的96孔培养板，在FITC通道中输入计数设置以校准仪器。然后读取细胞板，用铝箔包裹，并在4摄氏度下保存。接着检查各孔的图像，排除存在伪影斑块或细胞单层受损的孔，剔除细胞单层已受损的孔。