使用电化学发光测定法检测人胰岛自身抗体

为了检测胰岛自身抗体（1 型糖尿病的生物标志物），请采集人血清样本并添加乙酸以抑制干扰成分。

孵育，然后加入碱性缓冲液以中和酸。

将处理过的血清转移到含有人胰岛自身抗原混合物的多孔板中，包括生物素化捕获抗原和钌偶联抗原，每种抗原均具有测定的最佳浓度。

阳性样品中的胰岛自身抗体将钌偶联抗原桥接到生物素化捕获抗原，形成抗原抗体复合物。

将混合物转移到链霉亲和素包被的电化学发光板中，该板用封闭剂预处理并配备工作电极和对电极。

孵育以允许生物素化复合物与结合的链霉亲和素相互作用，然后洗涤。

加入含有三丙胺或TPA的缓冲液。

在电化学发光仪器中，电极之间的电压施加会引发钌和TPA的氧化，从而产生TPA自由基。

TPA 自由基激发钌络合物，钌络合物在返回基态时发射光子。

阳性样品中的高化学发光表明存在胰岛自身抗体。

人胰岛自身抗原与生物素或磺基标签以1：5摩尔的比例混合在管中，并用铝箔覆盖管，因为两个标签都对光敏感。然后，将试管在室温下孵育一小时。同时，在孵育进行时，用双重磷酸盐缓冲盐水灌注离心柱。

然后，以 1,000 倍 g 离心色谱柱，每次两分钟。接下来，将自身抗原标签混合物在离心柱中以1,000倍g离心2分钟。然后，等分试样并将标记的抗原储存在负 80 摄氏度。

接下来，使用基于棋盘测定的生物素磺基标签标记抗原的合理浓度作为抗原缓冲液，制备每96孔板3毫升抗原溶液。

然后在每个孔中加入 4 微升血清，并用 1 倍磷酸盐缓冲盐水将最终体积调整为 20 微升。然后，在每个孔中加入20微升标记的抗原溶液，并用密封箔覆盖板以防止光线照射。然后，将板转移到室温下的摇床上 2 小时。

摇床停止后，将盘子在 4 摄氏度的冰箱中放置 18 至 24 小时。现在，将每个样品的 15 微升血清与 18 微升 0.5 摩尔乙酸混合，并在室温下孵育 45 分钟。

棋盘测定的基础上，利用生物素磺基标签标记抗原的合理浓度制备抗原溶液。

然后，在新 PCR 板的每个孔中等分 35 微升抗原缓冲液。就在血清混合物孵育完成之前，沿抗原板上每个孔的侧面加入 3.8 微升 pH 值为 9 的 1 摩尔 Tris 缓冲液。

孵育结束后，在抗原板的每个孔中快速转移25微升醋酸处理的血清，并搅拌溶液。然后，用密封箔盖住PCR板避光，置于室温摇床上2小时。完成后，将板转移到冰箱中 4 摄氏度，孵育 18 至 24 小时。

链霉亲和素板从4摄氏度的冰箱中取出，让板达到室温。链霉亲和素板达到室温后，在每个孔中加入150微升3%阻断剂A，并用密封箔覆盖PCR板，在冰箱中孵育过夜。

第二天，从冰箱中取出链霉亲和素板，并将缓冲液从孔中排出。然后，将板倒置在一些干纸巾上，以浸泡剩余的缓冲液，以干燥板。然后，加入 150 微升 1 倍 PBST 缓冲液洗涤孔，连续洗涤 3 次。

接下来，将30微升血清抗原转移到链霉亲和素板的每个孔中孵育，并用箔纸覆盖板以避免光照。然后，将板在室温下在摇床上转移一个小时。一小时后，从板中弃去血清抗原孵育液，并加入150微升1倍PBST缓冲液洗涤孔3次。洗涤结束后，向每个孔中加入 150 微升读数缓冲液，以在酶标仪上读取。