探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

以下实验的总体目标是测量细胞核与其周围细胞骨架之间界面的力学特性及其物理连接。通过向接种在透明硅胶膜上的细胞施加机械应变，并成像由此引起的细胞核形变来实现该目标。细胞核形变程度增加表明细胞核刚度降低，因为核与细胞骨架之间的耦合变化也可能影响所诱导的细胞核形变。

通过向细胞骨架施加局部应变，可直接探测细胞骨架与细胞核之间的胞内力传递。随后对荧光标记的细胞核及细胞骨架结构的位移进行成像。所得结果展示了细胞核相对于周围细胞骨架的刚度。

根据底物应变实验，微针操控检测表明，核-细胞骨架偶联的破坏会导致细胞内力传递缺陷。与现有的微吸管抽吸分离细胞核等方法相比，这些技术的主要优势在于，能够在不干扰正常细胞结构的情况下，对细胞核力学特性和完整活细胞进行测量。这些方法有助于揭示核膜成分的变化如何影响细胞核的机械特性。

它们还可用于研究核力学在诸如LA神经病变或癌症等疾病中的作用。每个拉伸培养皿由一个定制的无底塑料皿和一个用于固定硅胶膜的塑料O形环组成，塑料皿直径为三英寸，硅胶膜作为细胞培养基质。制备拉伸培养皿时，将一块4英寸×4英寸的硅胶膜夹在O形环与培养皿之间，小心剪去多余的膜，用去离子水冲洗拉伸培养皿，然后在将硅胶膜包被细胞外基质分子之前对培养皿进行高压灭菌，并在膜底部中心的外侧标记一个参考点。

该标记点将有助于在单轴应变实验过程中识别相同的细胞。在参考点周围贴上两条平行的透明胶带，以限制膜在一个维度上的形成。为了提供最佳的细胞贴附，用每毫升三微克的纤维连接蛋白或任何合适的细胞外基质蛋白包被硅胶膜。

用一个倒置的10厘米聚苯乙烯培养皿盖住菌株培养皿，并于次日在4摄氏度下孵育过夜。用PBS冲洗膜一次，以去除多余的蛋白质。向培养皿中加入10毫升生长培养基，静置备用。

硅胶膜包被培养皿制备完成后，用0.05%胰蛋白酶消化细胞，并将贴壁细胞接种至培养皿中，加入生长培养基。本操作以小鼠胚胎细胞为例进行演示。

成纤维细胞或间充质细胞在正常培养条件下孵育24至48小时。用于基底应变实验的倒置显微镜配备有应变装置，该装置由一个可固定在显微镜载物台上的底板组成。底板上设有中央圆柱形铂金盘，用于对硅胶膜中央区域施加应变。

该装置还配备了一个可移动的平板，用于固定应变培养皿，可在四根导向销上上下滑动，并配有一个五磅重的砝码以施加负载。为了观察细胞核，将应变培养皿中的细胞在37摄氏度下与每毫升1微克的Hoechst染料孵育15分钟。孵育结束后，吸除培养基，并替换为15毫升不含酚红的生长培养基，其中含有25毫摩尔的HEPES。

然后将培养皿拧入培养皿支架中，并小心地在硅胶膜底部边缘涂抹润滑脂，以确保膜在中心铂金部件上顺畅滑动。注意保持膜的中央区域清洁无涂抹。将底板放置在显微镜载物台板上，并小心地将培养皿支架安装到底板上。

确保在初始静止位置时，拉伸培养皿中的硅胶膜松散地贴附在中央铂片上。接着，将焦点对准硅胶膜的底部，并找到中央的黑色参考点。该点将作为所有图像采集的起始位置，并有助于在拉伸过程中及拉伸后定位相同的细胞。

在此图像中，中央的光点充满整个视野。从光点的边缘开始，调节焦距以观察细胞和硅胶膜的表面。寻找细胞铺展良好且细胞核位于中央的细胞。

获取一张面部对比度图像，应聚焦于细胞轮廓和硅胶膜。然后获取细胞核钩染色的荧光图像，应聚焦于细胞核的中央平面。在获取5至15个细胞的图像后，返回中央点。

缓慢地将重量施加到应变培养皿上，从而实现均匀的应变加载，位置位于培养皿中心。最大施加的基底应变受限于应变施加后放置在垂直对准销上的尼龙垫片。聚焦于硅胶膜底部，并再次找到参考点，从该点开始操作。

重新定位相同的细胞，并再次获取每个细胞在完全应变条件下细胞核的相差图像和荧光图像末端，尽量与初始图像的焦平面保持一致。此过程不应超过10分钟，以避免细胞对异常基底产生主动重塑和适应。在获取所有对应的图像后，将显微镜载物台移回起始位置。

小心地从培养皿支架板上取下重物，如有必要，让硅胶膜松弛。轻轻向上推动应变培养皿，使其回到初始位置。然后采集相差图像和荧光图像。

对拉伸后细胞的成像，其方法与前述拉伸图像相同，通过分析拉伸前、拉伸中及拉伸后细胞及其荧光标记细胞核的图像，以计算归一化的细胞核应变。在本演示中，使用自行编写的MATLAB脚本进行分析，但也可采用其他多种替代方法手动计算基底所受应变，即通过匹配拉伸前和拉伸后图像中位于膜上的三至六个控制点的位置。MATLAB程序通过比较拉伸前与完全拉伸图像中对应控制点的位置，计算出膜所受的应变。

还将预训练和应变后图像之间的残余应变位置进行比较。控制点同时用于图像对的配准，以帮助检测受损或脱落的细胞。接下来，使用独立的 MATLAB 程序手动选择细胞核，该程序可计算每个单独细胞核的核应变。

这是通过匹配相应预全幅和应变后荧光图像中细胞核的大小，或通过匹配核内标记物以校正不同实验间施加的膜应变的微小差异来实现的。结果以归一化的核应变表示，定义为每个细胞核的诱导核应变与施加的膜应变之比。

MATLAB 脚本可根据要求向lambing实验室索取。最后一步是验证每个细胞核，并排除在施加应变过程中脱落或受损细胞的数据。在硅胶膜上分布在两个不同区域的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），在施加20%单轴应变之前、期间和之后，均通过相差显微镜和荧光显微镜进行成像。此处展示的是一个成功的实验示例，包含在应变施加过程中未发生损伤或脱落而存活细胞的有效细胞核。

相比之下，在施加应变过程中，此处所示的细胞发生收缩或部分脱落，因此被排除在分析之外。左侧细胞显示出细胞骨架损伤和细胞核塌陷的迹象，而右侧细胞在施加应变过程中部分脱落并发生收缩。这可能是应变过大的表现。

此处展示了一组 Lamin A/C 缺陷小鼠的不同甲基细胞系中归一化核应变的分析结果。这些细胞异位表达空载体或野生型 lamin A，与野生型同窝小鼠的细胞进行比较。核膜蛋白 Lamin A/C 表达缺失导致归一化核应变增加，表明细胞核刚度降低；而重新引入野生型 Lamin A 可部分或完全恢复核刚度。为准备微针操作实验，将35毫米玻璃底细胞培养皿在37摄氏度下用低浓度纤连蛋白孵育2小时；孵育结束后，用HBSS洗涤培养皿两次，并向其中加入2毫升生长培养基。

然后用0.05%胰蛋白酶消化小鼠胚胎成纤维细胞，并将细胞接种至纤连蛋白包被的玻璃底培养皿中，加入2毫升生长培养基。为获得单个贴壁且未融合的细胞，将细胞放回培养箱中过夜。染色时，在生长培养基中加入MIT tracker线粒体染料和Hoechst核染料，再将该生长培养基加入细胞中，随后进行孵育。

接着，在室温下用Hank's平衡盐溶液孵育细胞5分钟，以洗涤细胞。然后向细胞中加入不含酚红的培养基，并添加25毫摩尔的HEPES，用于成像。

进行微针实验时，将预先拉制好的微针插入显微操作器中，并将其连接至配备数字电荷耦合器件相机的倒置显微镜，对微针进行调焦，使其靠近单个细胞。在微针未插入细胞骨架的情况下，采集该单个细胞的一张图像。

在相差显微镜下，使用倒置显微镜配备60倍物镜和微操作仪，首先获取钩状结构3,3,3,4,2染色的一个荧光图像和线粒体染色的一个荧光图像；然后将微针小心插入距离核周一定距离的细胞质内，采集一张相差图像、一张钩状结构3,3,3,4,2染色的荧光图像以及一张线粒体染色的荧光图像。接着，使用计算机控制的微操作仪以每秒1微米的速度将微针向细胞边缘移动特定距离，同时每10秒自动采集一次图像。

当微针向细胞边缘移动特定距离时，应通过计算机控制显微操作仪，以实现一致的微操作。在微针从细胞中移除后，最终获取图像，然后分析微针操作前、操作中和操作后获得的荧光标记的细胞核和细胞骨架结构的细胞骨架图像，以计算细胞内微小区域的位移。在本示例中，使用自行编写的 MATLAB 脚本进行分析，但也可采用其他多种分析方法。

用于测量微针产生的位移的 MATLAB 脚本可根据要求向 Lambing 实验室索取。该 MATLAB 程序采用归一化互相关算法，计算荧光标记特征点原始位置与其新识别位置之间的偏移量。随后，位移将以矢量图形式显示，并以数值形式存储。

下一步是利用得到的位移矢量图，通过 MATLAB 确定细胞骨架或细胞核内的平均位移。首先，在施加应变位置的细胞骨架内选择三个或更多点。在位移矢量图中，取这些点的平均数值，以确定微针操作过程中在施加位置附近产生的细胞骨架应变程度。

接下来，在靠近施加应变位置的细胞核内选择三个或更多点，并取其平均值。该值代表微针施加位置附近细胞核的应变程度。采用相同方法，通过分别在远离应变施加区域的细胞核和细胞骨架区域中选取点，确定这些区域的细胞核和细胞骨架应变。

通过微针操作实验测量细胞内力的传递。图中显示的是成纤维细胞的相差图像和荧光图像，细胞经蓝色核染色剂和MIT tracker green线粒体染色剂标记。将一根微针插入细胞骨架中距细胞核特定距离的位置，随后向细胞边缘移动。

在线粒体发生细胞骨架应变之前、期间和之后，均观察到线粒体的位移，随后将这些位移以矢量形式绘出。每个矢量代表根据原始位置与新确定位置之间的偏移量计算出的位移。图像强度较低或纹理特征不足的区域被排除在分析之外。

随后，在对照成纤维细胞和成纤维细胞中，对距离应变施加位点越来越远的选定区域内的细胞骨架和细胞核位移进行了定量分析。在细胞核-细胞骨架耦联完整的细胞中，耦联力可传递至整个细胞，导致细胞核和细胞骨架发生形变，且这种形变随着远离应变施加位点而逐渐减弱。相反，细胞核-细胞骨架耦联受损的细胞仅在施加位点附近表现出局部位移，而在较远区域几乎无明显的诱导形变。

在对照成纤维细胞和核-细胞骨架偶联受损的成纤维细胞中，微针插入位点处的细胞骨架应变施加程度相似。然而，在远离应变施加位点的其他区域，核和细胞骨架的位移在核-细胞骨架偶联受损的成纤维细胞中显著小于对照细胞。因此，远离应变施加位点的细胞骨架和核位移减小表明细胞骨架与细胞核之间的力传递受到了干扰。

观看本视频后，您应能充分理解如何测量细胞核力学特性以及细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。您可以利用这些技术来研究核膜蛋白突变，或在发育过程及癌症中发生的核膜组成变化所产生的影响。