Name: 生物物理检测探头相间细胞核的力学性能:基材应变的应用和微针操纵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: 学习利用基材应变和微针操纵技术测量活细胞中细胞核与细胞骨架的力学性能。该方法通过荧光成像分析核变形，揭示核-细胞骨架耦联对细胞内力传递的影响，为细胞力学研究提供重要工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（R01 HL082792 和 R01 NS059348）及布莱根妇女医院心血管领导力小组奖资助。

1. 底物应变施加
归一化核应变的测量包括制备带有透明弹性硅胶膜作为细胞培养表面的应变培养皿，将细胞接种到培养皿上，以及在施加（单轴或双轴）应变之前、期间和之后获取细胞的图像。
硅胶膜培养皿的制备及细胞贴附
<ol>
	<li>每个应变培养皿由一个定制的无底塑料皿（直径为3英寸）和一个用于固定硅胶膜的塑料O型圈组成，硅胶膜作为细胞培养的基底。制备应变培养皿时，将一块4英寸×4英寸的硅胶膜夹在O型圈与培养皿之间。小心剪去多余的膜，用去离子水冲洗，并对应变培养皿进行高压灭菌处理。</li>
	<li>在用细胞外基质分子（如纤连蛋白）包被硅胶膜之前，先在膜底部中心位置（外侧）标记一个参考点。该标记有助于在应变实验过程中识别相同的细胞。（可选：若施加单轴应变，可在参考点周围粘贴两条平行的透明胶带，以限制膜在一个方向上的形变。）</li>
	<li>为提供最佳的细胞贴附条件，使用10 ml PBS稀释3 μg/ml纤连蛋白，对硅胶膜进行包被。用一个倒置的10 cm聚苯乙烯培养皿盖住应变培养皿，并在4°C下孵育过夜。</li>
	<li>次日，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗膜一次，以去除多余的蛋白。向培养皿中加入10 ml生长培养基（高糖DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素），备用。</li>
	<li>用0.05%胰蛋白酶消化小鼠胚胎成纤维细胞，并将其以约30%汇合度接种到包被好的硅胶膜培养皿中，在正常培养条件下孵育24–48小时。</li>
</ol>
底物应变实验
<ol start="6">
	<li>设置显微镜以进行实验。实验在倒置显微镜上进行，配备适用于荧光显微镜、相差或微分干涉（DIC）的数字相机，使用60倍物镜及相应的图像采集软件（例如 IPLab 或 Metamorph）。直立显微镜不适用于本应用。应变装置由一个可安装在显微镜载物台上的底板组成，底板上设有中央圆柱压头，用于对硅胶膜中央区域施加应变；还包括一个可沿四根导向销上下滑动的移动板，用于固定应变培养皿，以及一块5磅重的砝码板以施加负载。</li>
	<li>为观察细胞核，将应变培养皿中的细胞在37°C下与1 μg/mL Hoechst 33342孵育15分钟。吸除培养基后，加入15 mL不含酚红的生长培养基（不含酚红的高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagles Medium），含25 mM Hepes，并添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）。将应变培养皿旋入培养皿固定板中。在硅胶膜底部边缘均匀涂抹润滑脂（Braycote 804 真空润滑脂），以确保膜在中央压头表面能够顺畅滑动。注意保持膜中央区域清洁无遮挡。</li>
	<li>将底板放置于显微镜载物台上。小心地将培养皿固定板安装到底板上。确保在初始静止位置时，应变培养皿的硅胶膜松散地置于中央压头之上。</li>
	<li>首先聚焦于硅胶膜底部，找到中央的黑色参考点。该参考点将作为所有图像采集的起始位置，并有助于在拉伸过程中及之后定位相同的细胞。我们使用自行编写的自动成像程序来记录细胞位置并在实验过程中重新定位这些细胞，但也可手动完成。</li>
	<li>从参考点开始，调整焦距以观察细胞和硅胶膜顶部。选择铺展良好且细胞核位于中央的细胞，采集其相差图像和细胞核Hoechst染色的荧光图像。相差图像应聚焦于细胞轮廓和硅胶膜，而荧光图像应聚焦于细胞核的中央层面。</li>
	<li>在采集5至15个细胞的图像后，返回中央参考点。缓慢将砝码施加于应变培养皿上，从而在培养皿中央区域产生均匀的应变。最大施加的基底应变由垂直对准销（导向销）上的尼龙限位垫片限定。</li>
	<li>聚焦于硅胶膜底部并再次定位参考点。从该点出发，重新定位相同的细胞，并在完全应变状态下再次采集细胞和细胞核的相差及荧光图像，尽量与初始图像的焦平面保持一致。此过程不应超过10分钟，以避免细胞对受力基底产生主动重塑和适应。</li>
	<li>在完成所有对应图像的采集后，将显微镜载物台移回起始位置。小心地从培养皿固定板上移除砝码，使硅胶膜松弛。如有必要，轻轻向上推动应变培养皿，使其恢复至初始位置。然后按照上述应变图像的方法，采集应变释放后细胞的相差和荧光图像。</li>
</ol>
分析
<ol start="14">
	<li>对施加应变前后及期间的细胞图像和荧光标记的细胞核图像进行分析，以计算归一化的细胞核应变。在本实验室中，我们使用自行编写的 MATLAB 脚本进行分析，但也有多种其他可选方案。该分析分为三个步骤。</li>
	<li>首先，为计算施加的基底应变，需在膜上手动匹配3至6个控制点在应变前、完全应变和应变后图像中的位置。MATLAB 程序随后通过比较应变前与完全应变图像中对应控制点的位置，计算施加的膜应变，并同时计算应变前与应变后图像之间的残余应变。与此同时，这些控制点用于图像对的配准，有助于检测受损或脱离的细胞（见图1）。</li>
	<li>第二步，使用另一个独立的 MATLAB 程序手动选择细胞核，该程序通过匹配相应应变前、完全应变和应变后荧光图像中的细胞核大小或核内标记物，计算每个单独细胞核的细胞核应变。为校正不同实验间施加膜应变的微小差异，我们将结果表示为归一化细胞核应变，即每个细胞核的诱导细胞核应变与施加膜应变的比值。相关 MATLAB 脚本可根据请求从 Lammerding 实验室获取。</li>
	<li>最后，对每个细胞核进行验证，排除在施加应变过程中发生脱离或损伤的细胞的数据（见图1）。</li>
</ol>
2. 微针操作实验
培养皿、贴壁细胞和微针的制备
<ol>
	<li>将35 mm玻璃底细胞培养皿在37°C下，用低浓度纤连蛋白（0.5 μg/ml）的Hank's平衡盐溶液（HBSS）或其他合适的细胞外基质蛋白孵育2小时。用HBSS洗涤培养皿两次，然后在进行下一步前加入2 ml生长培养基。</li>
	<li>用0.05%胰蛋白酶消化小鼠胚胎成纤维细胞，并将其以7.5 × 104 个细胞/ml的密度接种于含2 ml生长培养基的纤连蛋白包被的玻璃底培养皿中。将细胞放回培养箱中孵育过夜。应优化细胞接种数量，以获得单个、贴壁且不融合的细胞，适用于其他细胞类型。</li>
	<li>使用商用移液管拉制仪（例如Sutter Instrument Company）将硼硅酸盐毛细管制成的微针拉制成尖端直径约为1至3 μm。</li>
</ol>
微针操作实验
<ol start="4">
	<li>次日，在生长培养基中加入MitoTracker线粒体染料（600 μM；Invitrogen）和Hoechst 33342核染料（1 μg/mL），在37°C培养箱中孵育细胞30分钟。</li>
	<li>在室温下用HBSS洗涤细胞一次，持续5分钟，然后向细胞中加入不含酚红的生长培养基以进行成像。</li>
	<li>使用倒置显微镜配备60倍物镜（0.70 N.A.，Plan-Achromat）和数字电荷耦合器件相机，获取单个细胞在未插入细胞骨架微针时的相差图像一张，Hoechst 33342染料的荧光图像一张，以及线粒体染料的荧光图像一张。</li>
	<li>使用显微操作器（例如InjectMan NI 2，Eppendorf），将微针小心插入细胞质中，距离核边缘固定距离（通常为5 μm），并获取一张相差图像、一张Hoechst 33342染料的荧光图像和一张线粒体染料的荧光图像。对于本应用，建议通过计算机（例如Windows Hyperterminal）控制显微操作器，以实现一致的微操作过程。</li>
	<li>以1 μm/sec的速度将微针向细胞边缘移动特定距离（通常为10或20 μm），同时每10秒同步采集一次荧光图像和相差图像。当微针向细胞边缘移动特定距离时，根据所选参数，在操作过程中将对应获得2-3帧图像。</li>
	<li>最后，在微针从细胞骨架移除后，再额外获取若干图像。</li>
</ol>
分析
<ol start="10">
	<li>使用定制编写的 MATLAB 脚本计算位移图，该脚本基于对细胞核和细胞质中荧光标记特征的追踪。（MATLAB 脚本可向 Lammerding 实验室申请获取）。该程序在连续图像帧中采用归一化互相关算法，对小图像区域（大小约为 10 μm × 10 μm，间隔 5 μm）进行分析。对于每个区域中心，程序计算其在 x 和 y 方向上的位移，即原始位置与新识别位置之间的偏移量，并以位移矢量形式显示，同时以数值形式存储。根据位移图，可计算预定义区域内的平均位移。需注意，细胞骨架的位移基于细胞骨架标记物的荧光通道（例如 MitoTracker 线粒体染料），而细胞核的位移则基于对应 Hoechst 33342 信号的荧光通道。在本应用中，我们常规分析以下区域：(i) 应变施加部位的细胞骨架应变，即微针插入部位；(ii) 细胞核内靠近应变施加部位的核应变区域；(iii) 远离应变施加部位的细胞核区域内的核应变；以及 (iv) 穿过细胞核的细胞质区域中的细胞骨架应变。此外，也可直接通过相差图像或 Hoechst 33342 荧光图像序列测量细胞核的伸长。在此情况下，施加的核应变通过将核伸长量（ΔL = L – L0）除以初始长度 L0 计算得到，其中 L 为应变施加结束时细胞核的最终长度，L0 为细胞核的初始长度。对于具有完整核-细胞骨架耦合的细胞，细胞核将朝向应变施加部位伸长。相反，在核-细胞骨架耦合受损的细胞中，即细胞骨架与细胞核之间力的传递效率降低，细胞核在应变施加方向上的伸长将显著减少。因此，细胞核在细胞骨架应变施加下形变减小，提示细胞核与细胞骨架之间存在（部分）去耦联。</li>
</ol>
3. 典型结果：
底物应变施加
我们在施加应变前后及过程中获取了来自杂合子和纯合子核纤层蛋白A/C缺陷型（Lmna+/– 和 Lmna–/–）以及野生型（Lmna+/+）小鼠的胚胎成纤维细胞的图像，并随后计算了每个细胞的归一化核应变。分析后，对细胞核进行有效性验证，并将施加应变过程中发生损伤或回缩的细胞从分析中剔除。图1A展示了三个有效细胞的细胞核，而图1B展示了应从分析中排除的细胞。归一化核应变数据汇总自至少三次独立实验（每次实验包含约5–10个细胞核的测量值），并通过统计学方法与其他细胞组或处理组进行比较。归一化核应变增加表明细胞核刚性降低，这在核膜蛋白lamin A/C表达减少的细胞中可见（图2）。
微针操作实验
在微针操控实验中，我们对局部细胞骨架应变施加过程中细胞核和细胞骨架的位移进行了成像。在分析中排除了受损或脱落的细胞。分析时，我们测量单个贴壁细胞中细胞核和细胞骨架朝向受力位点移动的幅度。例如，在图3中，我们追踪了施加细胞骨架应变前后线粒体（细胞骨架标记物）的位移，并将这些位移以矢量形式绘出。每个矢量代表通过原始位置与新确定位置之间的偏移量计算得到的位移。图像强度较低或纹理不足的区域（例如细胞外区域）在分析中被排除。随后，在距离应变施加位点逐渐增加的选定区域中量化细胞骨架和细胞核的位移（图4，对应于插图中彩色方框的区域）。在细胞核-细胞骨架连接完整的鼠胚胎成纤维细胞中，力可传递至整个细胞，导致细胞核和细胞骨架的形变，并随着远离应变施加位点而逐渐减弱（图4）。相比之下，细胞核-细胞骨架连接受损（或细胞骨架结构异常）的成纤维细胞仅在施加位点附近表现出局部位移，而在更远区域几乎无明显的诱导形变，如图4所示。在微针插入位点（橙色方框）处，对照组成纤维细胞（仅表达mCherry）与细胞核-细胞骨架连接破坏的成纤维细胞（DN KASH）表现出相似的细胞骨架应变施加水平。然而，在其他区域（蓝色、黄色和红色方框）中，细胞核-细胞骨架连接破坏的成纤维细胞（DN KASH）所诱导的细胞核和细胞骨架位移显著小于对照细胞（仅表达mCherry）（图4）。因此，随着远离应变施加位点，细胞骨架和细胞核位移的减小表明细胞骨架与细胞核之间的力传递受到了干扰。
重要的是，我们还通过微针操控实验验证了线粒体可作为合适的细胞骨架标记物。实验中使用转染了GFP-或mCherry-肌动蛋白以及GFP-波形蛋白，并用Mitotracker Green或Red荧光标记的鼠胚胎成纤维细胞。细胞骨架的位移图分别基于线粒体与肌动蛋白或波形蛋白的荧光信号独立计算。针对距离应变施加位点由近及远的四个不同细胞骨架区域，计算其平均绝对位移。通过线粒体与肌动蛋白或波形蛋白所得测量结果之间的线性回归分析，分别计算斜率和R²值。对于肌动蛋白，斜率为0.99，R2值为0.986；对于波形蛋白，斜率为1.04，R²值为0.971，结果证实线粒体的位移可作为细胞骨架形变的可靠指标。
<img src="/files/ftp_upload/3087/3087fig1.jpg" alt="细胞应变响应；相差显微镜，Hoechst染色分析；显微图像；形变研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）施加基底应变。 小鼠胚胎成纤维细胞在硅胶膜上分布于两个不同区域，在施加20%单轴应变之前、期间和之后，分别通过相差显微镜和荧光显微镜进行成像。（A）一次成功实验的示例，显示在应变施加过程中未发生损伤或脱落而存活的细胞中有效的细胞核；（B）在应变施加过程中发生回缩/部分脱落的细胞示例；来自（B）中所示细胞的数据不纳入分析。在（B）中，左侧细胞显示出细胞骨架损伤和细胞核塌陷的迹象（箭头），而右侧细胞在应变施加过程中部分脱落并回缩。这可能是应变施加过大的表现。为便于比较，在（A）和（B）中，将未拉伸状态下的一个细胞膜边界以红色标出，并叠加至同一细胞在应变施加期间和之后的图像上。在（A）中，未拉伸状态下的细胞核边界以绿色标出，并叠加至同一细胞核在应变施加期间和之后的图像上。
<img src="/files/ftp_upload/3087/3087fig2.jpg" alt="不同遗传背景和构建体中归一化核应变的柱状图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 不同 MEF 细胞系中归一化核应变的分析。 对具有 Lmna–/– 和 Lmna+/– 遗传背景的 MEF 细胞进行了分析，这些细胞异位表达了空载体或野生型 lamin A。与来自野生型同窝幼鼠的 MEF 细胞（Lmna+/+）相比，lamin A/C 表达的缺失导致核刚度降低，而重新引入野生型 lamin A 可完全恢复核刚度。值得注意的是，核刚度的降低表现为归一化核应变值的增加。误差线代表标准误差。
<img src="/files/ftp_upload/3087/3087fig3.jpg" alt="细胞成像系列；荧光显微镜；绿色与蓝色细胞染色；形态学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 微针操控实验用于测量细胞内力传递。 成纤维细胞经核染色（蓝色）和MitoTracker线粒体染色（绿色）标记后的相差（A, B）和荧光（C, D）图像。将一根微针插入细胞骨架中，位置距细胞核保持固定距离（A和C），随后向细胞边缘移动（B, D）。通过定制的互相关算法追踪荧光标记的细胞核和线粒体，定量分析细胞骨架和细胞核的位移。（E）基于荧光图像序列计算得到的最终细胞骨架（绿色）形变位移图；箭头长度放大2倍以增强可视性。比例尺，10 μm。
<img src="/files/ftp_upload/3087/3087fig4.jpg" alt="mCherry 与 DN KASH 在微针操作过程中细胞内力传递的位移（μm）比较；力施加位点分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 微针操作过程中细胞内力传递的分析。 在微针操作期间诱导的细胞骨架和细胞核位移，测量位置对应于彩色方框所示区域（A 图插图）。橙色方框为应变施加位点。尽管在细胞骨架（橙色方框）上的应变施加程度相似，但在核-细胞骨架耦联受损的小鼠胚胎成纤维细胞（DN KASH）中，诱导的细胞核和细胞骨架位移（蓝色、黄色和红色方框）显著小于对照组（仅表达 mCherry）细胞。

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
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<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
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<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

底物应变测定
我们及其他研究团队已成功应用应变加载技术，研究在机械应力作用下细胞核的形变，并探究特定核膜蛋白对细胞核刚性的贡献。4-8 该技术的优势在于，可在细胞正常的细胞内环境及细胞骨架背景下探测活细胞核的力学特性，且基底应变的施加方式类似于多种组织中所存在的生理负荷，例如收缩中的肌肉或血管壁。9 此外，该方法可同时对多个细胞施加应变，从而增加单次实验中可分析的细胞数量。基底应变检测的一个局限性在于其无法直接测量细胞核的刚性，而是用于确定细胞核相对于周围细胞骨架的相对刚性。对经受单轴基底应变的细胞中诱导产生的细胞核与细胞骨架应变进行详细分析表明，在野生型细胞中，细胞骨架的应变程度与所施加的基底应变相近，而更刚性的细胞核则形变显著更小。4 尽管如此，仍可能需要其他检测方法（如微针操控检测）来确认不同细胞系之间观察到的细胞核形变差异并非由核-细胞骨架耦合状态或细胞骨架结构的改变所致。尽管存在这些局限性，在完整细胞中而非在分离的细胞核中测量细胞核力学特性，可最大程度地降低因渗透效应、分离过程中的损伤或其他与细胞核分离相关的改变...

<table><tbody><tr><td>纤连蛋白</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red FM 和 Green FM</td><td>Invitrogen</td><td>M22425 和 M-7514</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Invitrogen</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>酚红-free，DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐玻璃</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>光面/光面无增强硅胶片，0.005&quot;</td><td>Specialty Manufacturing Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿（FluoroDish）</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Braycote 804 真空润滑脂</td><td>SPI Supplies</td><td>05133A-AB</td><td></td></tr></tbody></table>

探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

在大多数真核细胞中，细胞核是体积最大的细胞器，其刚性通常比周围的细胞骨架高2到10倍；因此，在生理和病理条件下，细胞核的物理特性对细胞整体的生物力学行为具有显著影响。例如，在迁移的中性粒细胞和侵袭性癌细胞中，细胞核的刚性可能在血管外渗或穿越组织内狭窄空间时构成主要障碍1。另一方面，处于机械活跃组织（如肌肉）中的细胞其细胞核需要足够的结构支撑，以承受反复的机械应力。重要的是，细胞核与细胞结构紧密整合；它在物理上与周围的细胞骨架相连，这对于细胞内细胞核的移动和定位至关重要，例如在极性细胞、神经肌肉接头处的突触核或迁移中的细胞中2。毫不奇怪的是，最近研究表明，核膜蛋白（如核纤层蛋白lamin和nesprin）的突变会引发多种人类疾病，这些蛋白在决定核刚性和核-细胞骨架耦联中起关键作用，相关疾病包括Emery-Dreifuss肌营养不良症、肢带型肌营养不良症和扩张型心肌病3。为了研究多种核膜蛋白的生物物理功能以及特定突变的影响，我们已开发出实验方法，用于研究在整体或局部机械扰动下单个活细胞中细胞核的物理特性。通过精确施加基底应变并测量由此引起的细胞核形变，可以获得有关细胞核可变形性的重要信息，并实现不同突变体或缺乏特定核膜蛋白的细胞系之间的定量比较。使用微针施加局部细胞骨架应变可作为该检测方法的补充，能够提供有关细胞核与细胞骨架之间细胞内力传递的额外信息。在完整活细胞中研究核力学可保留正常的细胞内结构，并避免使用分离细胞核时可能出现的人工假象。此外，基底应变施加为肌肉或其他组织中细胞所经历的生理应力（例如，暴露于血管应变下的血管平滑肌细胞）提供了良好的模型。最后，尽管这些工具主要被开发用于研究核力学，它们也可用于探究细胞骨架蛋白的功能及机械转导信号通路。

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。

在大多数真核细胞中，细胞核是最大的细胞器，通常比周围的细胞骨架硬2到10倍；因此，……

以下实验的总体目标是测量细胞核界面的力学特性及其与周围细胞骨架的物理连接。通过向接种在透明硅胶膜上的细胞施加机械应变，并成像由此引起的细胞核形变，即可实现该目标。细胞核形变程度越大，表明细胞核刚度越低，因为核-细胞骨架耦合性的变化也可能影响所诱导的细胞核形变。通过向细胞骨架施加局部应变，可直接探测细胞骨架与细胞核之间的细胞内力传递。随后对荧光标记的细胞核及细胞骨架结构的位移进行成像。所得结果展示了细胞核相对于周围细胞骨架的刚度。根据底物应变实验，微针操作检测表明，核-细胞骨架耦合的破坏会导致细胞内力传递缺陷。与现有的微吸管抽吸分离细胞核等方法相比，这些技术的主要优势在于，能够在不干扰正常细胞结构的情况下，实现对细胞核力学特性和完整活细胞的测量。这些方法有助于揭示核膜成分的变化如何影响细胞核的力学特性。它们还可用于研究核力学在诸如LA神经病变或癌症等疾病中的作用。每个拉伸培养皿由一个定制的无底塑料皿和一个用于固定硅胶膜的塑料O形环组成，塑料皿直径为三英寸，硅胶膜作为细胞培养基质。制备拉伸培养皿时，将一块4英寸×4英寸的硅胶膜夹在O形环与培养皿之间，小心剪去多余的膜，用去离子水冲洗拉伸培养皿，然后在将硅胶膜包被细胞外基质分子之前对培养皿进行高压灭菌，并在膜底部中心的外侧标记一个参考点。该标记点将有助于在单轴应变实验过程中识别相同的细胞。在参考点周围粘贴两条平行的透明胶带，以限制薄膜在某一维度上的形成。为了提供最佳的细胞贴附效果，用每毫升3微克的纤连蛋白或任何合适的细胞外基质蛋白包被硅胶膜。用一个倒置的10厘米聚苯乙烯培养皿盖住菌株培养皿，并于次日在4摄氏度下孵育过夜。用PBS冲洗膜一次，以去除多余的蛋白质。向培养皿中加入10毫升生长培养基，静置备用。制备好包被的硅胶膜培养皿后，用0.05%胰蛋白酶消化细胞，并将贴壁细胞接种到培养皿中，加入生长培养基。本操作以小鼠胚胎细胞为例进行演示。成纤维细胞或间充质细胞在正常培养条件下孵育 24 至 48 小时。用于基底应变实验的倒置显微镜配备有应变装置，该装置由可安装在显微镜载物台上的底板组成。底板上固定有一个中心圆柱形铂金柱，用于对硅胶膜的中央区域施加应变。该装置还配备了一个可移动的平板，用于承载拉伸培养皿，并可在四根导向销上上下滑动，同时配有一个五磅重的砝码以施加负荷。为观察细胞核，将拉伸培养皿中的细胞在37摄氏度下与浓度为每毫升1微克的Hoechst染色液孵育15分钟。孵育结束后，吸除培养基，并替换为15毫升含25毫摩尔HEPES的无酚红培养基。然后将培养皿拧入培养皿支架中，并在硅胶膜底部边缘仔细涂抹润滑脂，以确保膜在中央铂金表面顺畅滑动。注意保持膜的中央区域清洁无脂。将底板放置在显微镜载物台板上，并小心地将培养皿支架安装到底板上。确保在初始静止位置时，拉伸培养皿的硅胶膜松散地贴在中央平台之上。接着，将焦点对准硅胶膜的

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生物物理检测探头相间细胞核的力学性能：基材应变的应用和微针操纵

本文介绍一种快速、简单的细胞刚度测量方法。该方法的基本原理是通过微管对细胞表面施加明确定义的负压，测量细胞膜在负压作用下的形变。该方法为研究贴壁细胞的生物力学特性提供了一种强有力的工具。...

利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。...

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

本文描述了用于量化贴壁细胞与微结构基底之间机械相互作用的实验方案。这些相互作用与细胞迁移、增殖、分化和凋亡等基本细胞行为密切相关。本方案介绍了一款名为 MechProfiler...

微柱阵列上简便而精确的力学表征

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。...

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

利用先前设计的装置对贴壁细胞施加机械应变，本文描述了一种重新设计的基质几何结构以及一种定制设备，可用于使用100倍油浸物镜对受应变细胞进行高分辨率单细胞成像。...

在单轴拉伸应变下单个活细胞核动力学的高分辨率成像

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

我们介绍一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，并结合一系列递送后的检测，评估细胞的活力、增殖能力及弹性测量。...

通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。...

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

本文介绍一种利用基于电子学的微流控平台——机械节点孔传感（mechano-NPS）技术，对单个细胞进行机械表型分析的方法。该平台在测量细胞弹性与黏性等生物物理特性的同时，可保持每秒1至10个细胞的中等通量。...

机械-节点-孔传感：一种用于多参数单细胞黏弹性测量的快速无标记平台

在机械应力下探索细胞行为对于细胞力学和力学生物学的进步至关重要。我们介绍荧光微吸管抽吸（fMPA）技术，这是一种将可控的机械刺激与单细胞内信号通路的全面分析相结合的新型方法。该技术可推动活细胞力学生物学的深入研究。...

荧光微管吸吮法检测红细胞机械感知

学习利用基材应变和微针操纵技术测量活细胞中细胞核与细胞骨架的力学性能。该方法通过荧光成像分析核变形，揭示核-细胞骨架耦联对细胞内力传递的影响，为细胞力学研究提供重要工具。

探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

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