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从一个培养皿开始,其中含有经甲醛固定的、填充明胶的小鼠空肠冷冻切片,切片中包含具有顶端微绒毛和纺锤形胞体的簇细胞。
使用含有去污剂的缓冲液进行洗涤,以通透细胞膜。
加入碱性抗原修复液。孵育以打断固定引起的蛋白质交联,从而暴露蛋白质用于染色。
加入封闭液以防止非特异性抗体结合。
使用靶向一种在簇细胞中特异性磷酸化的肌动蛋白结合蛋白的一抗进行孵育。
去除未结合的抗体。加入荧光染料标记的二抗、DNA结合染料以及鬼笔环肽-荧光染料偶联物的混合液。
二抗与一抗结合,鬼笔环肽-荧光染料偶联物标记肌动蛋白,DNA结合染料标记细胞核。
去除未结合的组分,并加入不含去污剂的缓冲液。
将切片转移至经粘附剂包被的玻片上,用封片介质封片。
在共聚焦显微镜下,呈现绿色线轴状、在管腔顶端荧光增强并具有延伸的红色根状体团的细胞,提示存在簇细胞。
为制备空肠切片,首先将冷冻切片机腔室温度和样品温度均设置为零下22摄氏度。将冷冻的组织块放入冷冻切片机腔室内的冷冻模具中,至少放置15分钟。15分钟后,用刀片将组织块切开成两半,以暴露空肠的横切面。将其中一半组织块固定在冷冻切片机的适配器上。将充满明胶的空肠切成30微米厚的切片。使用冷冻镊子轻轻将切片转移至含有3毫升PBS的35毫米培养皿中。
用 3 毫升 PBS-T 每次 5 分钟,洗涤切片三次后,向含有游离切片的培养皿中加入 3 毫升新配制的抗原修复液。然后盖上盖子,用一段乙烯胶带密封培养皿与盖子之间的缝隙,在杂交孵育箱中于 50 摄氏度孵育 3 小时,不振荡。
免疫染色后,将含有染色切片的 PBS 培养皿转移至体视显微镜下。在经 AMS 涂层处理的白色玻片中央滴加 200 微升 PBS 液滴。然后,使用 P200 移液枪头将一段空肠组织切片从培养皿中转移至该液滴中。
调整切片位置对齐后,吸除切片周围所有残留的 PBS。加入 20 µL 水溶性封片剂,并将盖玻片置于封片剂上。立即用含二甲苯的封片剂封固盖玻片边缘,室温静置 2 至 3 小时,待其干燥后即可开始共聚焦显微镜观察。