一种基于免疫荧光的空肠冷冻切片中簇状细胞可视化的方法

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从含有福尔马林固定、明胶填充的小鼠空肠冷冻切片的培养皿开始,该培养皿具有具有顶端微绒毛和线轴状体细胞的簇状细胞。

用含洗涤剂的缓冲液洗涤以透化细胞膜。

加入碱性抗原修复溶液。孵育以破坏固定诱导的蛋白质交联,揭示蛋白质进行染色。

应用封闭溶液以防止非特异性抗体结合。

与靶向肌动蛋白结合蛋白的一抗叠加,特异性在簇状细胞中磷酸化。

去除未结合的抗体。引入荧光团偶联二抗、DNA 结合染料和鬼笔环肽荧光染料偶联物的混合物。

二抗与一抗结合,鬼笔环肽-荧光染料偶联物标记肌动蛋白,DNA结合染料标记细胞核。

去除未结合的组分并添加不含洗涤剂的缓冲液。

将切片转移到涂有粘合剂的载玻片上,用介质安装

。 在

共聚焦显微镜下,管腔尖端荧光增强的绿色线轴状细胞和延伸的红色根团块表明簇状细胞的存在。

要制备空肠切片,首先将低温恒温器室温度和物体温度设置为零下 22 摄氏度。将冷冻组织块放入低温恒温器室的冷冻模具中至少15分钟。15分钟后,用剃须刀片将块切成两半,露出空肠的横向部分。将块的一半安装在低温恒温器适配器上。将明胶填充的空肠切成 30 微米厚的切片。使用冷冻镊子轻轻地将切片转移到含有 3 毫升 PBS 的 35 毫米培养皿中。

用 3 毫升 PBS-T 洗涤切片 3 次,每次 5 分钟后,将 3 毫升新鲜制备的抗原修复溶液加入含有自由漂浮切片的培养皿中。然后,盖上盖子,用一条乙烯基胶带密封培养皿和盖子之间的间隙,并在杂交培养箱中在50摄氏度下孵育三个小时,不要摇晃。

免疫染色后,将PBS中染色切片的培养皿转移到立体显微镜上。将 200 微升 PBS 置于 AMS 涂层白色载玻片中心的液滴中。然后,使用 P200 移液器吸头将一个空肠切片从培养皿转移到液滴中。

调整切片对齐后,吸出切片周围所有剩余的PBS。加入 20 微升水性封片剂,并在介质顶部放置盖玻片。立即用二甲苯基封片剂密封盖玻片边缘,并在开始共聚焦显微镜检查之前让其干燥两到三个小时。

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Last updated: 18 July 2026