一种双标记免疫荧光技术,用于可视化受感染细胞中的宿主和病原体蛋白

0 次观看3:44 分钟 • July 8th, 2025

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从感染致病性寄生虫的固定和透化上皮细胞开始。

添加封闭缓冲液以防止非特异性抗体结合。

与小鼠多克隆一抗叠加,与寄生虫的蛋白质特异性相互作用。

添加与寄生蛋白结合一抗相互作用的远红荧光团标记的二抗。

洗涤以去除未结合的抗体。用与一抗结合的抗小鼠抗体进行阻断,最大限度地减少宿主蛋白标记过程中的交叉反应。

添加靶向上皮细胞内宿主核糖核蛋白的小鼠单克隆一抗。

与绿色荧光团标记的二抗和红色荧光团偶联鬼笔环肽的混合物叠加,分别促进宿主蛋白结合一抗和肌动蛋白的标记。

用缓冲液洗涤。使用含有 DNA 染色剂的培养基进行安装,赋予宿主核、寄生虫核和动质体蓝色

使用共聚焦显微镜分析样品。双标记免疫荧光技术显示绿色宿主蛋白和红色寄生蛋白,从而实现它们的精确亚细胞定位。

LLC-MK2细胞加入含有紫外线灭菌圆形盖玻片的24孔板中,并让它们沉降16小时。然后为了感染细胞,将含有克氏滦虫的上清液加入每个孔中,并孵育六小时。接下来,用PBS洗涤含有感染和未感染细胞的盖玻片5次。

然后,用 2% 多聚甲醛和 PBS 固定细胞。10分钟后,用PBS洗涤盖玻片3次,每次5分钟,然后用非离子洗涤剂透化盖玻片10分钟。

三次 5 分钟的 PBS 洗涤后,将盖玻片在封闭溶液中孵育 30 分钟,然后与小鼠单克隆或多克隆抗体再孵育 30 分钟。洗涤后,将盖玻片与封闭溶液中的二抗和鬼笔环肽一起孵育30分钟,以染色宿主细胞中的肌动蛋白丝。

然后,再次用PBS洗涤盖玻片3次,然后将少量含有DAPI介质的防褪色封片试剂涂在载玻片表面。使用镊子在介质中轻轻倾斜盖玻片以防止气泡形成。

对于双标记,如前所述孵育盖玻片和封闭溶液后,将它们在小鼠多克隆抗体中孵育30分钟。接下来,用PBS洗涤盖玻片3次,每次5分钟,然后与二抗孵育30分钟。

然后在三次PBS洗涤后,使用在封闭溶液中稀释的AffiniPure兔抗小鼠IgG执行第二个封闭步骤。30分钟后,再次用PBS洗涤盖玻片,然后再与小鼠单克隆抗体孵育30分钟。

接下来,在三次PBS洗涤后,将盖玻片与山羊抗小鼠IgG2b抗体和鬼笔环肽一起孵育。然后,在三次PBS洗涤后,如前所述应用防褪色封片试剂。

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最后更新:1 八月 2026