一种用于检测成年海马神经发生的免疫荧光染色技术

取包含海马齿状回的小鼠脑切片，该区域是神经发生部位，含有处于不同分化阶段的神经前体细胞。

将切片转移至通透-封闭液中。溶液中的去垢剂分子可使细胞通透，而蛋白质则可封闭非特异性结合位点。

加入针对特定神经发生标志物、微管相关蛋白和中间丝蛋白的一抗混合液。

去除未结合的抗体。加入不同荧光染料标记的二抗，使其与一抗结合。

加入与其中一种一抗同源的血清蛋白，以饱和二抗上的抗原结合位点（paratopes）。

引入单价Fab片段以饱和血清蛋白的表位，防止非特异性结合。

加入第二种同源宿主产生的初级抗体，该抗体结合另一种中间丝蛋白。

加入针对第二种一抗的荧光标记二抗。

利用荧光显微镜，鉴定表达独特标记组合的神经祖细胞亚型。

使用细刷将切片从抗冻液转移至TBS中。彻底冲洗切片，先在4摄氏度下过夜洗涤，随后在室温下进行五次、每次10分钟的洗涤。所有这些孵育步骤均应在持续轻柔振荡条件下进行。

如果感兴趣的抗原之一是胸腺嘧啶类似物，则此时需进行盐酸变性步骤，随后在硼酸盐缓冲液中进行中和。接着在 TBS-plus 中对非特异性抗体结合位点进行透化和封闭。室温下孵育 1 小时。

然后，在含有TBS增强液的第1种一抗中4摄氏度孵育过夜。次日，用TBS洗涤切片3次，再用TBS-T洗涤1次，每次洗涤持续10分钟。随后，在室温下用第1种荧光染料标记的二抗孵育3小时。自此以后，需避免切片暴露于光照。

经过另一轮洗涤后，将切片转移至由两种一抗来源的宿主物种制备的10%血清溶液中。在该溶液中孵育切片3小时，以饱和第一种二抗上的游离抗原结合位点。随后，用TBS清洗三次，再用TBS-T清洗一次，以去除残留血清。

然后，配制含有50微克/毫升针对一抗宿主物种的未标记单价Fab片段的TBS-plus溶液。该溶液可封闭可能被第二轮二抗识别的表位。将切片转移至该溶液中，并在4摄氏度下孵育过夜。

孵育结束后，用 TBS 至少冲洗切片三次，再用 TBS-T 冲洗一次。转移过程中，将含有切片的网状插入物在纸巾上轻轻擦拭，以去除残留的 Fab 成分。接着，将切片在第二种一抗溶液中于 4 摄氏度下孵育过夜。

再次进行洗涤后，在室温下加入第二抗体孵育三小时。最后，用TBS缓冲液洗涤切片三次，随后将切片置于明胶中封片。将载玻片自然晾干，并使用抗荧光淬灭封片剂加盖盖玻片。