一种用于肾脏三维成像的全器官整体染色技术

取一个固定的小鼠肾脏。组织中的脂质会导致光散射，色素会导致光吸收，从而使细胞不透明。

使用CUBIC-L试剂对组织进行脱脂和脱色处理。CUBIC-L中的氨基醇可去除脂质和色素，从而最大限度地减少光散射并提高组织透明度。

CUBIC-L 中的去垢剂分子也能使细胞通透化。

加入一种一抗混合液，该混合液可结合交感神经元细胞质中的酪氨酸羟化酶以及血管平滑肌细胞中的α-平滑肌肌动蛋白。

加入可与一抗结合的荧光标记二抗。

进行组织后固定以保存抗体处理效果。

将组织浸入CUBIC-R+中，该试剂可置换水并匹配蛋白质的折射率，从而进一步减少光散射，提高组织透明度。

在光片荧光显微镜下，光片照射组织，激发荧光分子。

捕获荧光团发射的光信号，重建三维图像，展示肾脏动脉周围交感神经的分布情况。

首先，在灌注固定和肾脏取样后立即进行浸入式固定，即将肾脏浸入4%多聚甲醛中，在4摄氏度下固定16小时。用PBS洗涤三次，每次两小时。将固定后的肾脏置于14毫升圆底管中，加入7毫升50% CUBIC-L溶液，在室温下轻轻振荡，进行脱色和脱脂处理。

六小时后，将肾脏置于含有七毫升 CUBIC-L 的 14 毫米圆底管中，在 37 摄氏度下轻轻振荡孵育五天。每天更换一次 CUBIC-L。脱色与脱脂完成后，使用分配勺处理样品，并在室温下用 PBS 洗涤肾脏三次，每次两小时。

将脱脂的肾脏在含有初级抗体的染色缓冲液中进行免疫染色，在37摄氏度的摇床培养箱中轻轻振荡孵育七天。随后，用含0.5% Triton X-100的PBS（即PBST）在室温下洗涤肾脏一天。进行二抗染色时，将肾脏置于染色缓冲液中的二抗溶液中，避光、在37摄氏度下轻轻振荡孵育七天。最后用PBST在室温下洗涤一天，以固定染色结果。

固定后，将肾脏置于含1%甲醛的PB溶液中浸泡3小时，随后在室温下用PBS洗涤6小时。将肾脏放入14毫升圆底管中，加入7毫升50% CUBIC-R+溶液，振荡孵育1天进行折射率匹配，接着更换为7毫升CUBIC-R+溶液，在室温下继续振荡处理2天。