0 次观看 • 4:09 分钟 • July 8th, 2025
取帕金森病患者的皮肤活检冷冻切片，该切片包埋于包埋介质中。
该组织由最外层的表皮、其下方的真皮以及由神经支配的皮下脂肪构成。
洗涤切片以去除包埋介质。将切片转移至通透-封闭溶液中，对细胞进行通透处理并封闭非特异性结合位点。
将切片浸入一抗混合液中，以实现均匀的抗体标记，该方法称为游离漂浮染色。
抗体进入神经元并与沿轴突分布的α-突触核蛋白聚集物以及羧基末端水解酶结合——其中α-突触核蛋白的聚集形式是神经退行性疾病的特征性表现。
加入与一抗结合的荧光染料标记二抗。
使用荧光DNA结合染料处理，以染色细胞核。
将组织置于载玻片上，加入封片介质，并用盖玻片封片。
在共聚焦显微镜下，两种抗体的荧光显示皮肤神经元轴突中存在α-突触核蛋白聚集体。
首先，取一个新的96孔板，将其中部分孔加入100微升洗涤液。将储存板中待分析的切片转移至含有洗涤液的孔中，在室温下静置10分钟。随后，将每张切片转移至另一个含有相同洗涤液的空孔中，重复洗涤一次。接下来，向切片中加入洗涤液，并将其转移至新的含有100微升封闭液的孔中。室温孵育至少90分钟，最长不超过4小时。
将一抗 PGP9.5 和 5G4 用工作液稀释。将切片转移至新的孔中，每孔加入 100 µL 一抗工作液，于室温孵育过夜。
第二天，按照之前所述方法，将切片在含有洗涤液的孔板中进行洗涤。用工作液稀释二抗——山羊抗兔抗体用于检测抗 PGP9.5，山羊抗鼠抗体用于检测 5G4。
将洗涤后的切片转移至含有100微升二抗工作液的新孔中。用铝箔包裹培养板以避免荧光素与二抗结合后发生褪色，并在室温下孵育90分钟。
此后，按照前述方法用洗涤液将切片洗涤两次。将洗涤后的切片转移至新的孔板中，加入100 µL DAPI，室温孵育5分钟。再次按照前述方法用洗涤液将切片洗涤两次。然后将切片正确放置于载玻片上，避免折叠错位。
向载玻片滴加数滴封片剂，然后盖上盖玻片。将载玻片室温避光过夜干燥。次日，将载玻片置于适当的盒中，于4摄氏度保存，注意避免光照。
使用倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜观察切片。通过连接显微镜的相机采集图像。然后，根据文本方案中所述，使用荧光显微镜或共聚焦显微镜分析切片中阳性信号的空间分布和信号强度。