一种用于成像斑马鱼放射状胶质前体细胞中 Notch/DeltaD 信号通路的抗体摄取检测方法

将含有去壳的斑马鱼胚胎并包埋于琼脂糖中的培养皿置于显微镜载物台上。

取含有低浓度抗体偶联物的染料溶液，该溶液包含红色荧光标记的抗体和抗DeltaD抗体。

将染料溶液注入胚胎的后脑脑室，靶向正在活跃分裂的放射状胶质前体细胞或RGP。

释放包埋的胚胎，并在富含营养的培养基中回收。

在恢复过程中，荧光偶联物与放射状胶质前体细胞（RGP）上的少量 Notch 配体 DeltaD 分子相互作用，启动内吞作用和内体形成。

低浓度的偶联物使得未结合的DeltaD配体能够与Notch受体相互作用，从而在放射状胶质前体细胞（RGPs）中激活Notch信号通路。

复苏后，将带有琼脂糖的麻醉胚胎转移至玻璃培养皿中，使其背侧朝下，以便成像。

进行延时荧光成像以捕获细胞分裂过程，结果显示含有DeltaD的荧光内体不对称地分配至两个子细胞中，证实Notch/DeltaD信号通路被激活。

将包埋的胚胎置于体视显微镜下，并用胚胎水覆盖琼脂糖。使用显微操作器设置空气压力注射仪，将其放置在显微镜附近。采用高压钢瓶装的气态氮气作为气源。

将胚胎固定在琼脂糖中后，打开气体阀门。使用显微注射仪的前端加样模块，在显微操作器上将2微升抗体混合物加入制备好的玻璃针尖中。随后将输入压力调节至80至90磅每平方英寸，注射压力调节至20磅每平方英寸。

在显微镜下使用千分尺校准注射体积。根据针头开口的大小，将调谐时间设置为10至120毫秒。踩下踏板以输送每次注射脉冲，并调节每次输送的注射体积至4至5纳升。

然后，将显微注射针的尖端穿过菱脑背侧的顶板，在菱脑节0/1铰链点后方，注入约10纳升抗体混合物，注意避免触碰脑组织。观察脑室中红色液体的流动情况。

注射后，通过旋转显微操作仪的旋钮，迅速将针尖从胚胎中移出。若注射成功，注入混合物中的红色染料将稳定保留在脑室中，不会渗漏至周围的琼脂糖凝胶内。移动载片板至显微镜下，寻找下一个已固定的胚胎，将其调整至合适位置以进行重复操作。

注射6至8个胚胎后，使用显微外科手术刀剥离琼脂糖，使胚胎从包埋的琼脂糖中释放出来。将显微注射后的胚胎转移至含有30毫升胚胎培养基的新培养皿中，并于室温下放置以进行后续步骤。30分钟后，将筛选出的胚胎转移至10毫升胚胎培养基中。

为固定胚胎，准备含有相同浓度三卡因的0.8%低熔点琼脂糖溶液于离心管中。使用玻璃移液器将注射后的胚胎浸入温热的琼脂糖中持续三秒钟。随后立即用同一根玻璃移液器将胚胎从琼脂糖中取出，并将带有少量管中琼脂糖液滴的胚胎置于35毫米玻璃底培养皿的中央。

使用纤维探针或加样枪头轻轻调整胚胎方向，使胚胎脑部的背侧尽可能靠近玻璃底部。在琼脂糖逐渐凝固的过程中，轻柔地转动胚胎位置，使胚胎伸展而不弯曲。之后，通过翻转玻璃底培养皿检查类胚胎的位置。

确保在显微镜下能够观察到包含正确安装胚胎的整个背侧前脑。加入 2 至 3 毫升含三卡因的、预热至